本發(fā)明屬于免疫分析和生物傳感技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種基于負(fù)載rh@pd納米枝晶的磺化碳納米管的免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

目前宮頸癌已經(jīng)成為危害女性健康的重要因素。宮頸癌腫瘤標(biāo)志物的靈敏檢測，在臨床上對于腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)，腫瘤高危人群的篩選、良性和惡性腫瘤的鑒別診斷、腫瘤發(fā)展程度的判斷，腫瘤的治療效果的觀察和評價及腫瘤復(fù)發(fā)和預(yù)后的預(yù)測產(chǎn)生極大的影響，引起人們的廣泛關(guān)注。

目前電化學(xué)免疫傳感器已經(jīng)廣泛用于宮頸癌及各種腫瘤標(biāo)志物的檢測，一般可分為有標(biāo)記和無標(biāo)記兩種，其中無標(biāo)記型電化學(xué)免疫傳感器結(jié)合了高特異性的免疫分析技術(shù)和高靈敏的電化學(xué)分析技術(shù)，具有靈敏度高、制備簡單、檢測快速、成本低等優(yōu)點，在臨床檢驗、環(huán)境監(jiān)測、食品安全控制、生物監(jiān)測等領(lǐng)域都有重要的應(yīng)用價值。

本發(fā)明成功構(gòu)建了一種基于負(fù)載rh@pd納米枝晶的磺化碳納米管的無標(biāo)記型免疫傳感器，rh@pd雙金屬為納米枝晶狀，具有良好的水溶性和催化性能，具有更多的結(jié)合位點，能有效吸附并固載抗體。磺酸功能化的多壁碳納米管具有優(yōu)異的導(dǎo)電性，大的比表面積，良好的穩(wěn)定性和生物相容性。二者通過物理靜電吸附作用相互結(jié)合，由于二者的協(xié)同作用有助于提高材料的電化學(xué)性質(zhì)，能夠更好的對測定信號實現(xiàn)放大，提高腫瘤標(biāo)志物檢測的靈敏度。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種基于負(fù)載rh@pd納米枝晶的磺化碳納米管的免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用，實現(xiàn)了對宮頸癌標(biāo)志物的靈敏檢測。

本發(fā)明的目的之一是提供一種基于負(fù)載rh@pd納米枝晶的磺化碳納米管的免疫傳感器的制備方法。

本發(fā)明的目的之二是將所制備的基于負(fù)載rh@pd納米枝晶的磺化碳納米管的免疫傳感器應(yīng)用于宮頸癌癌標(biāo)志物的高靈敏、特異性檢測。

本發(fā)明的技術(shù)方案，包括以下步驟。

1.一種基于負(fù)載rh@pd納米枝晶的磺化碳納米管的免疫傳感器的制備方法，步驟如下：

（1）將直徑為3~5mm的玻碳電極用al2o3拋光粉打磨，超純水清洗干凈；

（2）取6μl、1.0~3.0mg/ml的負(fù)載rh@pd納米枝晶的磺化碳納米管分散液滴涂到電極表面，室溫下晾干，超純水沖洗電極表面，晾干；

（3）繼續(xù)將6μl、8~10μg/ml的腫瘤標(biāo)志物捕獲抗體ab1滴加到電極表面，超純水沖洗，4°c冰箱中干燥；

（4）繼續(xù)將4μl、0.8~1.2mg/ml的牛血清白蛋白bsa溶液滴加到電極表面，超純水沖洗電極表面，4°c冰箱中晾干；

（5）滴加6μl、25fg/ml~100ng/ml的一系列不同濃度的腫瘤標(biāo)志物抗原ag溶液，超純水沖洗電極表面，4°c冰箱中晾干，制得一種基于負(fù)載rh@pd納米枝晶的磺化碳納米管的免疫傳感器。

2.所述rh@pd納米枝晶的制備，步驟如下：

取2ml、10~20mmol/l的na2pdcl4與0.5ml、10~20mmol/l的rhcl3·3h2o混合，置于50ml圓底燒瓶中，加入20mg聚醚f127，超聲溶解后，依次加入40μl，6mol/l的鹽酸，5ml、0.5mol/l的抗壞血酸，繼續(xù)超聲至溶液變?yōu)楹谏?，將圓底燒瓶放入45°c水浴中，在強磁力攪拌下加熱5.0~6.0h，分別用超純水和無水乙醇離心洗滌，將離心后的產(chǎn)物于40°c下烘干12h，制得rh@pd納米枝晶。

3.所述磺化碳納米管的制備，步驟如下：

稱取2~3g多壁碳納米管，在60°c下真空爐中干燥24h；稱取1~1.5g烘干后的多壁碳納米管置于圓底燒瓶中，依次緩慢加入10ml濃硫酸，30ml濃硝酸，超聲10min至溶液分散均勻，于120°c油浴中，攪拌回流10~30min，自然冷卻至室溫，用超純水洗滌至中性，60°c下烘干10~15h，制得磺化碳納米管；

4.所述負(fù)載rh@pd納米枝晶的磺化碳納米管分散液的制備，步驟如下：

稱取10mg上述制備的磺化碳納米管，分散在10~20ml、1mg/ml的rh@pd納米枝晶分散液中，室溫下連續(xù)攪拌15h，離心分離，35°c下真空干燥箱中烘干，制得負(fù)載rh@pd納米枝晶的磺化碳納米管；

稱取5~15mg的負(fù)載rh@pd納米枝晶的磺化碳納米管超聲分散至5mlph7.2的pbs緩沖溶液中制得負(fù)載rh@pd納米枝晶的磺化碳納米管分散液；

所述1mg/ml的rh@pd納米枝晶分散液是將10mgrh@pd納米枝晶分散至10ml超純水中制得。

5.腫瘤標(biāo)志物的檢測，檢測步驟如下：

（1）使用電化學(xué)工作站以三電極體系進行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，所制備的傳感器為工作電極，在10ml，含10mmol/l的鐵氰化鉀的ph=5.8~8.0磷酸鹽緩沖溶液中進行測試；

（2）用差分脈沖伏安法對分析物進行檢測，初始電位為0v，終止電位為0.5v，脈沖振幅為50mv，脈沖寬度為50ms，脈沖周期為50ms，記錄電流變化；

（3）記錄不同濃度下的腫瘤標(biāo)志物抗原所對應(yīng)的電流峰值；

（4）利用工作曲線法，得到待測樣品中腫瘤標(biāo)志物抗原的濃度。

上述腫瘤標(biāo)志物選自下列之一：cea、ca125、scca。

本發(fā)明所用原材料均可在化學(xué)試劑公司或生物制藥公司購買。

本發(fā)明的有益成果

（1）采用負(fù)載rh@pd納米枝晶的磺化碳納米管作為基底材料。rh@pd雙金屬為納米枝晶狀，具有良好的水溶性和催化性能，納米枝晶狀的形貌，使其具有更多的結(jié)合位點，能有效吸附并固載抗體?；撬峁δ芑亩啾谔技{米管具有優(yōu)異的導(dǎo)電性，大的比表面積，良好的穩(wěn)定性和生物相容性。二者通過物理靜電吸附作用相互結(jié)合，由于二者的協(xié)同作用有助于提高材料的電化學(xué)性質(zhì)，實現(xiàn)了放大電化學(xué)信號的作用，從而提高了傳感器的靈敏度，降低了檢測限。

（2）一種基于負(fù)載rh@pd納米枝晶的磺化碳納米管的免疫傳感器對腫瘤標(biāo)志物的檢測，對cea檢測的線性范圍25fg/ml~100ng/ml，檢測限為8.3fg/ml；對ca125其檢測的線性范圍100fg/ml~100ng/ml，檢測限為33.3fg/ml；對scca檢測的線性范圍25fg/ml~100ng/ml，檢測限為8.3fg/ml；表明一種基于負(fù)載rh@pd納米枝晶的磺化碳納米管的免疫傳感器可以達(dá)到準(zhǔn)確測定的目的。

具體實施方式

現(xiàn)將本發(fā)明通過具體實施方式進一步說明，但不限于此。

實施例1一種基于負(fù)載rh@pd納米枝晶的磺化碳納米管的免疫傳感器的制備方法，步驟如下：

（1）將直徑為3mm的玻碳電極用al2o3拋光粉打磨，超純水清洗干凈；

（2）取6μl、1.0mg/ml的負(fù)載rh@pd納米枝晶的磺化碳納米管分散液滴涂到電極表面，室溫下晾干，超純水沖洗電極表面，晾干；

（3）繼續(xù)將6μl、8μg/ml的腫瘤標(biāo)志物捕獲抗體ab1滴加到電極表面，超純水沖洗，4°c冰箱中干燥；

（4）繼續(xù)將4μl、0.8mg/ml的牛血清白蛋白bsa溶液滴加到電極表面，超純水沖洗電極表面，4°c冰箱中晾干；

（5）滴加6μl、25fg/ml~100ng/ml的一系列不同濃度的腫瘤標(biāo)志物抗原ag溶液，超純水沖洗電極表面，4°c冰箱中晾干，制得一種基于負(fù)載rh@pd納米枝晶的磺化碳納米管的免疫傳感器。

實施例2一種基于負(fù)載rh@pd納米枝晶的磺化碳納米管的免疫傳感器的制備方法，步驟如下：

（1）將直徑為4mm的玻碳電極用al2o3拋光粉打磨，超純水清洗干凈；

（2）取6μl、2.0mg/ml的負(fù)載rh@pd納米枝晶的磺化碳納米管分散液滴涂到電極表面，室溫下晾干，超純水沖洗電極表面，晾干；

（3）繼續(xù)將6μl、9μg/ml的腫瘤標(biāo)志物捕獲抗體ab1滴加到電極表面，超純水沖洗，4°c冰箱中干燥；

（4）繼續(xù)將4μl、1.0mg/ml的牛血清白蛋白bsa溶液滴加到電極表面，超純水沖洗電極表面，4°c冰箱中晾干；

（5）滴加6μl、25fg/ml~100ng/ml的一系列不同濃度的腫瘤標(biāo)志物抗原ag溶液，超純水沖洗電極表面，4°c冰箱中晾干，制得一種基于負(fù)載rh@pd納米枝晶的磺化碳納米管的免疫傳感器。

實施例3一種基于負(fù)載rh@pd納米枝晶的磺化碳納米管的免疫傳感器的制備方法，步驟如下：

（1）將直徑為5mm的玻碳電極用al2o3拋光粉打磨，超純水清洗干凈；

（2）取6μl、3.0mg/ml的負(fù)載rh@pd納米枝晶的磺化碳納米管分散液滴涂到電極表面，室溫下晾干，超純水沖洗電極表面，晾干；

（3）繼續(xù)將6μl、10μg/ml的腫瘤標(biāo)志物捕獲抗體ab1滴加到電極表面，超純水沖洗，4°c冰箱中干燥；

（4）繼續(xù)將4μl、1.2mg/ml的牛血清白蛋白bsa溶液滴加到電極表面，超純水沖洗電極表面，4°c冰箱中晾干；

（5）滴加6μl、25fg/ml~100ng/ml的一系列不同濃度的腫瘤標(biāo)志物抗原ag溶液，超純水沖洗電極表面，4°c冰箱中晾干，制得一種基于負(fù)載rh@pd納米枝晶的磺化碳納米管的免疫傳感器。

實施例4所述rh@pd納米枝晶的制備，步驟如下：

取2ml、10mmol/l的na2pdcl4與0.5ml、10mmol/l的rhcl3·3h2o混合，置于50ml圓底燒瓶中，加入20mg聚醚f127，超聲溶解后，依次加入40μl，6mol/l的鹽酸，5ml、0.5mol/l的抗壞血酸，繼續(xù)超聲至溶液變?yōu)楹谏?，將圓底燒瓶放入45°c水浴中，在強磁力攪拌下加熱5.0h，分別用超純水和無水乙醇離心洗滌，將離心后的產(chǎn)物于40°c下烘干12h，制得rh@pd納米枝晶。

實施例5所述rh@pd納米枝晶的制備，步驟如下：

取2ml、15mmol/l的na2pdcl4與0.5ml、15mmol/l的rhcl3·3h2o混合，置于50ml圓底燒瓶中，加入20mg聚醚f127，超聲溶解后，依次加入40μl，6mol/l的鹽酸，5ml、0.5mol/l的抗壞血酸，繼續(xù)超聲至溶液變?yōu)楹谏?，將圓底燒瓶放入45°c水浴中，在強磁力攪拌下加熱6.0h，分別用超純水和無水乙醇離心洗滌，將離心后的產(chǎn)物于40°c下烘干12h，制得rh@pd納米枝晶。

實施例6所述rh@pd納米枝晶的制備，步驟如下：

取2ml、20mmol/l的na2pdcl4與0.5ml、20mmol/l的rhcl3·3h2o混合，置于50ml圓底燒瓶中，加入20mg聚醚f127，超聲溶解后，依次加入40μl，6mol/l的鹽酸，5ml、0.5mol/l的抗壞血酸，繼續(xù)超聲至溶液變?yōu)楹谏?，將圓底燒瓶放入45°c水浴中，在強磁力攪拌下加熱6.0h，分別用超純水和無水乙醇離心洗滌，將離心后的產(chǎn)物于40°c下烘干12h，制得rh@pd納米枝晶。

實施例7所述磺化碳納米管的制備，步驟如下：

稱取2g多壁碳納米管，在60°c下真空爐中干燥24h；稱取1g烘干后的多壁碳納米管置于圓底燒瓶中，依次緩慢加入10ml濃硫酸，30ml濃硝酸，超聲10min至溶液分散均勻，于120°c油浴中，攪拌回流10min，自然冷卻至室溫，用超純水洗滌至中性，60°c下烘干10h，制得磺化碳納米管。

實施例8所述磺化碳納米管的制備，步驟如下：

稱取2.5g多壁碳納米管，在60°c下真空爐中干燥24h；稱取1.2g烘干后的多壁碳納米管置于圓底燒瓶中，依次緩慢加入10ml濃硫酸，30ml濃硝酸，超聲10min至溶液分散均勻，于120°c油浴中，攪拌回流20min，自然冷卻至室溫，用超純水洗滌至中性，60°c下烘干12h，制得磺化碳納米管。

實施例9所述磺化碳納米管的制備，步驟如下：

稱取3g多壁碳納米管，在60°c下真空爐中干燥24h；稱取1.5g烘干后的多壁碳納米管置于圓底燒瓶中，依次緩慢加入10ml濃硫酸，30ml濃硝酸，超聲10min至溶液分散均勻，于120°c油浴中，攪拌回流30min，自然冷卻至室溫，用超純水洗滌至中性，60°c下烘干15h，制得磺化碳納米管。

實施例10所述負(fù)載rh@pd納米枝晶的磺化碳納米管分散液的制備，步驟如下：

稱取10mg上述制備的磺化碳納米管，分散在10ml、1mg/ml的rh@pd納米枝晶分散液中，室溫下連續(xù)攪拌15h，離心分離，35°c下真空干燥箱中烘干，制得負(fù)載rh@pd納米枝晶的磺化碳納米管；

稱取5mg的負(fù)載rh@pd納米枝晶的磺化碳納米管超聲分散至5mlph7.2的pbs緩沖溶液中制得負(fù)載rh@pd納米枝晶的磺化碳納米管分散液；

所述1mg/ml的rh@pd納米枝晶分散液是將10mgrh@pd納米枝晶分散至10ml超純水中制得。

實施例11所述負(fù)載rh@pd納米枝晶的磺化碳納米管分散液的制備，步驟如下：

稱取10mg上述制備的磺化碳納米管，分散在15ml、1mg/ml的rh@pd納米枝晶分散液中，室溫下連續(xù)攪拌15h，離心分離，35°c下真空干燥箱中烘干，制得負(fù)載rh@pd納米枝晶的磺化碳納米管；

稱取10mg的負(fù)載rh@pd納米枝晶的磺化碳納米管超聲分散至5mlph7.2的pbs緩沖溶液中制得負(fù)載rh@pd納米枝晶的磺化碳納米管分散液；

所述1mg/ml的rh@pd納米枝晶分散液是將10mgrh@pd納米枝晶分散至10ml超純水中制得。

實施例12所述負(fù)載rh@pd納米枝晶的磺化碳納米管分散液的制備，步驟如下：

稱取10mg上述制備的磺化碳納米管，分散在20ml、1mg/ml的rh@pd納米枝晶分散液中，室溫下連續(xù)攪拌15h，離心分離，35°c下真空干燥箱中烘干，制得負(fù)載rh@pd納米枝晶的磺化碳納米管；

稱取15mg的負(fù)載rh@pd納米枝晶的磺化碳納米管超聲分散至5mlph7.2的pbs緩沖溶液中制得負(fù)載rh@pd納米枝晶的磺化碳納米管分散液；

所述1mg/ml的rh@pd納米枝晶分散液是將10mgrh@pd納米枝晶分散至10ml超純水中制得。

實施例13腫瘤標(biāo)志物cea的檢測，檢測步驟如下：

（1）使用電化學(xué)工作站以三電極體系進行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，所制備的傳感器為工作電極，在10ml，含10mmol/l的鐵氰化鉀的ph=5.8~8.0磷酸鹽緩沖溶液中進行測試；

（2）用差分脈沖伏安法對分析物進行檢測，初始電位為0v，終止電位為0.5v，脈沖振幅為50mv，脈沖寬度為50ms，脈沖周期為50ms，記錄電流變化；

（3）記錄不同濃度下的腫瘤標(biāo)志物抗原所對應(yīng)的電流峰值；

（4）利用工作曲線法，測定樣品中cea的線性范圍為25fg/ml~100ng/ml，檢測限為8.3fg/ml。

實施例14腫瘤標(biāo)志物scca的檢測

按照實施例13的方法對樣品中scca進行檢測，其線性范圍為25fg/ml~100ng/ml，檢測限為8.3fg/ml。

實施例15腫瘤標(biāo)志物ca125的檢測

按照實施例13的方法對樣品中ca125進行檢測，其線性范圍100fg/ml~100ng/ml，檢測限為33.3fg/ml。