本發(fā)明屬于油桐脂肪酸的分析方法技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種以微量油桐種仁為原料直接快速進行桐油脂肪酸分析的方法。

背景技術(shù)：

油桐(verniciafordii)是我國四大木本油料樹種(油桐、油茶、核桃、烏桕)之一，其種仁含油率高達70％，其種子榨出的桐油是一種優(yōu)良的干性植物油，具有干燥快、比重輕、有光澤、防濕等特性，是高級油膝、涂料工業(yè)的重要環(huán)保原料，又可供制生物柴油、人造橡膠、醫(yī)藥等用途。在當今環(huán)保能源日趨緊張和國家發(fā)展生物質(zhì)能源的背景下，桐油作為重要的生物環(huán)保能源材料之一，對于開發(fā)我國環(huán)保能源和提高我國能源自給自足能力有重要的戰(zhàn)略意義。但到目前為止，油桐品種繁多，且對桐油的研究及應(yīng)用尚處于起步階段，存在的突出問題是成本過高，理論和現(xiàn)實差距大，許多關(guān)鍵技術(shù)有待突破，如何挖掘出好品種以及如何利用油桐這一寶貴資源尤為重要，推進油桐規(guī)?；l(fā)展是當前科研工作者艱巨的任務(wù)，也是幫助山區(qū)農(nóng)民脫貧致富的手段之一。

良種選育時桐油中不同脂肪酸，尤其是桐酸含量，是重點關(guān)注的性狀和指標。就前期的研究來看，桐油的常規(guī)檢測工作首先要利用石油醚浸染和索式抽提儀器將桐油從種仁中抽提出來，或者利用壓榨技術(shù)提取桐油，之后，再進行甲酯化檢測。這種常規(guī)檢測工作所需樣品量大，成本高，耗時長，操作復(fù)雜，不利于生產(chǎn)上的快速檢測。同時，從目前公開報導(dǎo)的方法來看，提取油脂的方法存在提取不充分，影響油脂性質(zhì)，溶劑有一定的毒性以及環(huán)境污染等問題。所以如果能夠直接利用微量的油桐種仁作為原料快速分析桐油脂肪酸，則可以大大的減少成本和縮短桐油性質(zhì)的檢測時間，防止由于操作時間過長而影響桐油性質(zhì)，進而可以加快油桐良種選育的工作；同時，對發(fā)育早期含油量少的種仁脂肪酸也可以檢測，這為研究桐油脂肪酸積累過程提供了重要技術(shù)支撐。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種免去繁瑣的桐油提取步驟，而且原料用量很少，反應(yīng)更為快速的桐油脂肪酸分析方法，該方法處理原料得到的產(chǎn)物完全不影響用于對桐油脂肪酸進行定性定量分析和檢測。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：

本發(fā)明使用微量的油桐種仁粉末，在堿催化下直接用甲醇進行萃取，用正庚烷甲酯化，獲取脂肪酸甲酯可用于氣相色譜等分析。

利用微量油桐種仁直接快速分析脂肪酸的方法：

將氫氧化鈉-甲醇溶液加入油桐種仁粉末樣品中，超聲波反應(yīng)，用冰醋酸使油脂徹底水解，用正庚烷將油脂甲酯化，完成反應(yīng)。

所述的利用微量油桐種仁直接快速分析脂肪酸的方法：油桐種仁粉末樣品的用量為0.01-0.1g，優(yōu)選0.01-0.05g。

所述的利用微量油桐種仁直接快速分析脂肪酸的方法：油桐種仁粉碎至50～100目。

所述的利用微量油桐種仁直接快速分析脂肪酸的方法：氫氧化鈉-甲醇溶液的加入比例為5-10ml氫氧化鈉-甲醇溶液/0.1g油桐種仁粉末樣品，優(yōu)選10ml氫氧化鈉-甲醇溶液/0.1g油桐種仁粉末樣品。

所述的利用微量油桐種仁直接快速分析脂肪酸的方法：甲醇溶液中氫氧化鈉的質(zhì)量百分比為1-10％。

所述的利用微量油桐種仁直接快速分析脂肪酸的方法：甲醇溶液中氫氧化鈉的質(zhì)量百分比優(yōu)選為6-8％，進一步優(yōu)選為5％。

所述的利用微量油桐種仁直接快速分析脂肪酸的方法：超聲波頻率30-50khz，功率40-60w，優(yōu)選超聲頻率40khz，功率50w。

所述的利用微量油桐種仁直接快速分析脂肪酸的方法：超聲處理時溫度為40℃-50℃，優(yōu)選50℃；時間10-60min，優(yōu)選20-40分鐘，進一步優(yōu)選30分鐘。

所述的利用微量油桐種仁直接快速分析脂肪酸的方法：超聲波反應(yīng)后按照1g油桐種仁粉末樣品/0.5ml-1ml冰醋酸的比例使油脂徹底水解；優(yōu)選1g油桐種仁粉末樣品/1ml冰醋酸。

所述的利用微量油桐種仁直接快速分析脂肪酸的方法：按照1g油桐種仁粉末樣品/50ml-100ml正庚烷的比例進行甲酯化，1-10min完成反應(yīng)，優(yōu)選1g油桐種仁粉末樣品/100ml正庚烷的比例進行甲酯化，2-10min完成反應(yīng)，進一步優(yōu)選2min。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點：

1、油桐種仁使用量少，0.01-0.1g粉末即可檢測；樣品用量比現(xiàn)有其他方法減少約50倍；

2、無需提取桐油，減少了操作步驟，避免桐油性質(zhì)改變；

3、操作簡單，大大的減少了成本；

4、利用超聲波和堿化甲醇浸染提高了反應(yīng)速度和脂肪酸甲酯化率的要求；

5、縮短樣品甲酯化時間，50min左右完成檢測，比普通方法耗時減少約10倍，大大的節(jié)省了時間成本；

6、本發(fā)明處理原料得到的產(chǎn)物完全不影響用于對桐油脂肪酸分析進行定性定量分析和檢測。

本發(fā)明首次提供一種利用微量油桐種仁直接快速分析脂肪酸的新工藝，即用有機溶劑萃取油脂，然后再用有機溶劑對種仁內(nèi)的油脂直接進行脂肪酸甲酯化。采用本工藝，對設(shè)備要求低，與傳統(tǒng)桐油檢測工藝相比，該工藝操作簡單，成本低、速度快、對環(huán)境污染小，具有很好的科研價值。

附圖說明

圖1為葡萄桐znl-p005家系桐油常規(guī)的脂肪酸甲酯氣相色譜圖(實施例1的結(jié)果)；

圖2、3、4為本發(fā)明不同質(zhì)量油桐種仁粉末脂肪酸甲酯氣相色譜圖(實施例2的結(jié)果)；

圖5、6、7為本發(fā)明不同濃度有機溶劑萃取油桐種仁粉末脂肪酸甲酯氣相色譜圖(實施例3的結(jié)果)；

圖8、9、10為本發(fā)明不同超聲反應(yīng)時間油桐種仁粉末脂肪酸甲酯氣相色譜圖(實施例4的結(jié)果)。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。

油桐品種：中南林業(yè)科技大學葡萄桐四個優(yōu)良家系znl-p005、znl-p007、znl-p009、znl-p012

油桐種仁粉末的獲得：

將油桐種子在60℃的烘箱內(nèi)烘干至恒重，去除種子外殼，利用研缽體或粉碎機將種仁磨成粉末。

實施例1

現(xiàn)有的常規(guī)方法提取桐油及其脂肪酸檢測分析

選用了葡萄桐znl-p005、znl-p007、znl-p009、znl-p012家系成熟(11月15日)種仁和znl-p012家系6月15日、7月15日、8月15日、9月15日、10月15日、11月15日6個不同發(fā)育時期種仁考察桐油常規(guī)的脂肪酸檢測分析。

1、桐油提?。?/p>

(1)按索氏的濾紙筒的粗細要求做好若干濾紙筒，用棉線綁緊，線頭要短，濾紙筒編好號，紙筒底部要塞上脫脂棉，用鉛筆塞好，防止油桐種仁粉抽提過程中漏出。

(2)根據(jù)索氏的每個樣品重量要求4g≤g≦6g，每個品種的3次重復(fù)的樣品總量要18克左右才能滿足實驗的需求。稱出每個品系種子的重量，記錄品種名和數(shù)據(jù)。再將種子的種殼去掉，稱出種仁的重量記錄，用粉碎機分別打磨至50～100目。

(3)每一品種的種仁粉用編好號的兩個濾紙筒稱出3份，每個濾紙筒裝5g的樣品粉，稱量時要注意把了小量杯和濾紙筒的重量歸零，記錄種仁粉的重量。然后將裝有種仁試樣粉的濾紙筒上部用鉛筆塞好棉花，封住開口，再用棉線綁緊，線頭要短。

(4)每次將索氏的抽濾筒洗干凈烘干后，待涼后稱量，稱出其重量并記錄。將裝有樣品的濾紙筒對應(yīng)的裝進索氏的試樣筒，將其拉上去。分別加入50ml的石油醚，再將其放到索氏的抽濾筒位置，拉下拉桿，檢查抽濾筒擰緊后，打開閥門，放下試樣筒，使試樣侵入石油醚，進行抽提。

(5)索氏主要有三個提取時間，第一個提取時間是將試樣在溫度90℃下浸提4h，運行完畢后將試樣拉上來。第二個提取時間是在溫度90℃下噴淋抽提4h,運行完完畢后將關(guān)上閥門，使石油醚結(jié)束回流。第三個提取時間是使抽濾筒里的石油醚揮發(fā)到只剩下提取的油脂為止,提取溫度90攝氏度。索氏的程序運行完后，抽濾筒里沒有石油醚的味道后，將抽濾筒涼后稱量其筒和油的重量，并記錄。

2、桐油脂肪酸檢測分析

用移液管吸取約0.01g油樣于錐形瓶中，用量筒量取40ml甲醇溶液于裝有油樣的錐形瓶中，加入0.5mol/l氫氧化鉀-甲醇溶液與油樣中，并加入幾粒沸石，連接回流裝置，在75℃水浴鍋中加熱回流30min，回流過程要不斷搖動燒杯，直到溶液澄清為止，取出錐形瓶，冷卻至室溫。將燒瓶中的溶液轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，并用20ml正庚烷洗滌錐形瓶，將洗滌液也倒入分液漏斗中，再向分液漏斗加40ml蒸餾水，靜置分層。再用20ml正庚烷萃取下層液，將其與酯層合并，再用20ml蒸餾水對酯相洗滌3次，直到廢水呈中性為止。最后分離出酯相，收集到燒杯中。用無水硫酸鈉干燥酯相，再倒入100ml容量瓶中，并定容。取1μl樣品，用氣相色譜儀進行分析(采用標準品比對)，結(jié)果表明四個家系桐油脂肪酸成分相似，都含有棕櫚酸c16:0、硬脂酸c18:0、油酸c18:1、亞油酸c18:2δ9,12、亞麻酸c18:3δ9,12,15、α-桐酸α-c18:3δ9,11,13和β-桐酸β-c18:3δ9,11,13七種脂肪酸成分，只是每個家系各種脂肪酸成分之間的百分含量上有差異(如表1)，整個過程耗時10h左右，樣品用量5g左右。

表1油桐不同家系桐油脂肪酸成分的常規(guī)檢測

實施例2

選用了葡萄桐znl-p005家系成熟種仁考察利用微量油桐種仁直接快速分析脂肪酸方法的可行性。

分別將0.01g、0.05g和0.1g的種仁粉末置于50ml離心管中，分別加入1ml、5ml、10ml的5％氫氧化鈉-甲醇溶液，將離心管置于頻率40khz，功率50w，作用溫度為50℃的超聲波中反應(yīng)30min。待反應(yīng)完成后取出，分別加入0.01ml、0.05ml、0.1ml冰醋酸和1ml、5ml、10ml正庚烷，充分振蕩，靜置2min后分層，取0.5ml上層液于1.5ml離心管中，14000rpm離心10min，取1μl上層液上氣相色譜儀對其脂肪酸成分進行分析(采用標準品比對)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)樣品量過多，在短時間未能徹底完成反應(yīng)，從而導(dǎo)致脂肪酸成分分析出現(xiàn)偏差且未知的雜質(zhì)也較多，因此優(yōu)選0.01g樣品(如表2和圖2～4)。

表2不同質(zhì)量油桐種仁粉末脂肪酸含量比較結(jié)果

實施例3

選用了葡萄桐znl-p007家系成熟種仁考察利用微量油桐種仁直接快速分析脂肪酸方法的可行性。

將0.01g的種仁粉末置于15ml離心管中，分別加入1ml的1％、5％和10％氫氧化鈉-甲醇溶液，將離心管置于頻率40khz，功率50w，作用溫度為50℃的超聲波中反應(yīng)30min。待反應(yīng)完成后取出，加入0.01ml冰醋酸和1ml正庚烷，充分振蕩，靜置2min后分層，取0.5ml上層液于1.5ml離心管中，14000rpm離心10min，取1μl上層液上氣相色譜儀對其脂肪酸甲酯成分進行分析(采用標準品比對)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同濃度氫氧化鈉-甲醇溶液對種仁脂肪酸的甲酯化效果有影響，雖然在脂肪酸成分分析上沒有影響(如表3)，但是1％與10％氫氧化鈉-甲醇溶液下處理的樣品在脂肪酸成分分析時雜質(zhì)較多導(dǎo)至峰值較多，而5％氫氧化鈉-甲醇溶液下處理的樣品的雜質(zhì)較少(如圖5～7)，因此優(yōu)選5％氫氧化鈉-甲醇溶液。

表3不同濃度氫氧化鈉-甲醇溶液油桐種仁粉末脂肪酸含量比較結(jié)果

實施例4

選用了葡萄桐znl-p009家系成熟種仁考察利用微量油桐種仁直接快速分析脂肪酸方法的可行性。

將0.01g的種仁粉末置于15ml離心管中，加入1ml的5％氫氧化鈉-甲醇溶液，將離心管置于頻率40khz，功率50w，作用溫度為50℃的超聲波中分別反應(yīng)10min、30min、60min。待反應(yīng)完成后取出，加入0.01ml冰醋酸和1ml正庚烷，充分振蕩，靜置2min后分層，取0.5ml上層液于1.5ml離心管中，14000rpm離心10min，取1μl上層液上氣相色譜儀對其脂肪酸成分進行分析(采用標準品比對)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲反應(yīng)30min后，脂肪酸的甲酯化效果較好(如圖9，10)，雖然超聲反應(yīng)10min不影響脂肪酸成分分析(如表4)，但是脂肪酸甲酯溶液有較多的雜質(zhì)(如圖8)，因此優(yōu)選超聲反應(yīng)30min。

表4不同反應(yīng)時間油桐仁粉末脂肪酸含量比較結(jié)果

實施例5

選用了葡萄桐znl-p012家系成熟種仁考察利用微量油桐種仁直接快速分析脂肪酸方法的可行性。

將0.01g的種仁粉末置于15ml離心管中，分別加入1ml的5％氫氧化鈉-甲醇溶液，將離心管置于頻率40khz，功率50w，作用溫度為50℃的超聲波中反應(yīng)30min。待反應(yīng)完成后取出，加入0.01ml冰醋酸和1ml正庚烷，充分振蕩，分別靜置1min、2min、5min、10min后分層，取0.5ml上層液于1.5ml離心管中，14000rpm離心10min，取1μl上層液上氣相色譜儀對其脂肪酸成分進行分析(采用標準品比對)，結(jié)果表明正庚烷在2min后完成脂肪酸甲酯化反應(yīng)，時間過早影響脂肪酸成分的甲酯化結(jié)果，超過2min后脂肪酸成分的甲酯化不再變化(如表5)，因此優(yōu)選2min甲酯化時間。

表5不同甲酯化時間油桐仁粉末脂肪酸含量比較結(jié)果

實施例6

選用了葡萄桐znl-p012家系6個不同發(fā)育時期種仁考察利用微量油桐種仁直接快速分析脂肪酸方法的可行性。

將0.01g的種仁粉末置于15ml離心管中，分別加入1ml的5％氫氧化鈉-甲醇溶液，將離心管置于頻率40khz，功率50w，作用溫度為50℃的超聲波中反應(yīng)30min。待反應(yīng)完成后取出，加入0.01ml冰醋酸和1ml正庚烷，充分振蕩，分別靜置2min后分層，取0.5ml上層液于1.5ml離心管中，14000rpm離心10min，取1μl上層液上氣相色譜儀對其脂肪酸成分進行分析(采用標準品比對)，結(jié)果表明早期6月15日和7月15日的油桐種仁中沒有桐酸，從8月15日開始才有桐酸，且隨著種仁的成熟桐酸含量逐漸增加，直到種仁成熟后桐酸含量穩(wěn)定，桐酸是決定桐油性質(zhì)的主要脂肪酸成份，是桐油性質(zhì)決定的重要指標。

表6不同發(fā)育時期油桐仁粉末脂肪酸含量比較結(jié)果

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。