本發(fā)明公開了一種檢測卡，具體涉及一種pct熒光微球免疫層析檢測試劑卡，本發(fā)明還是涉及該pct熒光微球免疫層析檢測試劑卡的制備方法。
背景技術(shù)：
：降鈣素原（procalcitonin,pct）是一個小分子蛋白，分子量約為13kda，通常由甲狀腺的c細胞產(chǎn)生。pct現(xiàn)已被看作是伴隨有全身性炎癥和敗血癥的主要標(biāo)志物。pct由calc-1基因編碼，是降鈣素的前體。pct來源于降鈣素原前體，后者由141個氨基酸組成，去除信號肽（1-25位氨基酸）后得到含有116個氨基酸殘基的pct，pct經(jīng)過連續(xù)的裂解，最終形成三個分子，分別是n端片段（n端pct，57個氨基酸殘基），降鈣素（32個氨基酸殘基）和抗鈣素（21個氨基酸殘基）。1993年，有報道發(fā)現(xiàn)pct水平在細菌系統(tǒng)感染患者中有所升高（1）。經(jīng)證實，與炎癥相關(guān)的pct并非由甲狀腺c細胞產(chǎn)生，而是由所有薄壁組織和已分化類細胞產(chǎn)生（2-4）。pct是一種很理想的細菌感染標(biāo)志物，因為它在正常人中濃度非常低，而病毒性感染只會使pct濃度略微升高。此外，pct更重要的診斷價值在于它的濃度與炎癥的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。除了炎癥或敗血癥能引起pct升高外，手術(shù)、多處創(chuàng)傷、高溫休克、燒傷和心源性休克有時同樣可以導(dǎo)致pct濃度的升高。此外，多項研究已證實心臟手術(shù)或心臟移植后pct水平監(jiān)測的重要性，pct的改變可以用來鑒別急性排斥反應(yīng)和由細菌或者真菌引起的感染。在正常及健康的個體中，其血清濃度極低，僅為10-50pg/ml，一般方法檢測不到。在全身性細菌、真菌及寄生蟲感染，系統(tǒng)炎癥反應(yīng)綜合癥、敗血癥、急慢性肺炎、急性胰腺炎、活動性肝炎、創(chuàng)傷等患者的血清pct水平異常增高，其濃度比正常水平大幾倍甚至上萬倍；其在病毒感染，自身免疫性疾病，器官移植排除反應(yīng)等患者血清中的濃度不增高或輕微增高。這現(xiàn)象決定了pct的高度特異性，因此可用于此類疾病的鑒別診斷，在全身性細菌感染和膿毒癥輔助鑒別診斷、預(yù)后判斷、療效觀察等方面有很高的臨床價值，可廣泛用于icu病房、血液科、外科、內(nèi)科、器官移植科、治療實驗室等。目前pct在醫(yī)院和血液系統(tǒng)廣泛使用標(biāo)記免疫分析技術(shù)是放射免疫分析(ria)和酶免疫分析(eia)，但在實際應(yīng)用中存在以下缺陷：放射免疫分析的放射性核素污染；酶聯(lián)免疫的酶的活性容易失活，酶的大分子標(biāo)記容易影響被標(biāo)記物的空間結(jié)構(gòu)。免疫層析(lateralflowimmunoassay，lfia)技術(shù)是近幾年來國內(nèi)外興起的一種快速診斷技術(shù)。lfia以硝酸纖維素膜(nc膜)為載體，先將特異的抗體(抗原)固定于nc膜的某一區(qū)帶，當(dāng)膜條一端滴加樣品(尿液或血清)后，由于毛細管作用，樣品將沿著該膜向前移動，當(dāng)移動至固定有抗體(抗原)的區(qū)域時，樣品中相應(yīng)的抗原(抗體)即與該抗體發(fā)生特異性結(jié)合，用免疫膠體金等染色可使該區(qū)域顯示一定的顏色，從而實現(xiàn)特異性的免疫診斷。目前的lfia快速檢測試劑盒多以膠體金、彩色乳膠顆?；蛘邿晒馑刈鳛闃?biāo)記物?；谀z體金標(biāo)記技術(shù)開發(fā)的快速檢測產(chǎn)品，存在靈敏度低、主要應(yīng)用于定性或者半定量、批間差異較大等問題；基于彩色乳膠顆粒雖然批間差異有所改善，但靈敏度依然較低，也只能說明定性或半定量；基于熒光素標(biāo)記技術(shù)的免疫層析靈敏度得到很大提高，能進行定量檢測，但是由于樣本中含有較高的熒光本底信號，且stock位移較小，會對檢測產(chǎn)生較大的影響。時間分辨熒光(time-resolvedfluorescence，trf)是一種非同位素?zé)晒鈽?biāo)記物，與普通熒光相比，具有stock位移大，熒光壽命長等特點，可以有效的避免樣品中的本底熒光，以及激發(fā)光等雜散光的影響，因此相比普通的熒光具有更高的靈敏度和抗干擾能力。中國專利zl201610031801.3公開了一種時間分辨熒光定量檢測pct的試劑盒，但是該試劑盒對熒光微球抗體復(fù)合物制備要求高，-80℃低溫和需要凍干，檢測靈敏度低，僅0.1ng/ml，并且只能僅檢測血清，檢測時間長，需要20分鐘。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種操作方便，可以同時檢測出低濃度和高濃度的pct抗原，并且檢測結(jié)果可靠的pct熒光微球免疫層析檢測試劑卡。本發(fā)明的另外一個目的是提供上述檢測試劑卡的制備方法。為此，本發(fā)明提供的第一個技術(shù)方案是這樣的：一種pct熒光微球免疫層析檢測試劑卡，包括底板，所述的底板上依次銜接有樣品墊、結(jié)合墊、包被膜和吸收墊，所述的結(jié)合墊噴涂有兩種不同粒徑熒光微球標(biāo)記的pct抗體，以及熒光微球標(biāo)記的雞igy；所述的包被膜t線位置包被有抗pct抗體，c線位置包被有羊抗雞igy。作為本發(fā)明的進一步優(yōu)選，上述的一種pct熒光微球免疫層析檢測試劑卡，所述的兩種不同粒徑熒光微球是粒徑為100nm熒光微球和300nm熒光微球。作為本發(fā)明的進一步優(yōu)選，上述的一種pct熒光微球免疫層析檢測試劑卡，所述的粒徑為100nm熒光微球和300nm熒光微球的比重為5:1~7:1。本發(fā)明提供的后一個技術(shù)方案為：一種pct熒光微球免疫層析檢測試劑卡的制備方法，在底板上依次銜接有pvc底板、樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維膜和吸水紙，所述的結(jié)合墊采用下述方法依次制得的：1）制備100nm熒光微球標(biāo)記抗pct抗體在1ml0.1mph6.0的4-羥乙基哌嗪乙磺酸中加入100nm粒徑的熒光微球和抗pct抗體，兩者比重為1:5~1:20；加入10mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽溶液，室溫反應(yīng)30min，16000rpm離心30min，去上清，加入保存液，超聲混勻；2）制備300nm熒光微球標(biāo)記抗pct抗體在1ml0.1mph6.0的4-羥乙基哌嗪乙磺酸中加入300nm粒徑的熒光微球和抗pct抗體，兩者比重為1:10~1:50；加入10mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽溶液，室溫反應(yīng)30min，16000rpm離心30min，去上清，加入保存液，超聲混勻；3）制備熒光微球標(biāo)記雞igy抗體在1ml0.1mph6.0的4-羥乙基哌嗪乙磺酸中加入熒光微球和雞igy，兩者比重為1:5~1:20；加入10mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽溶液，室溫反應(yīng)30min。16000rpm離心30min，去上清，加入保存液，超聲混勻；4）將上述步驟1）和步驟2）所制備的100nm、300nm粒徑熒光微球按重量比5:1~7:1混合，混合后離心去上清，用添加了0.1%sds、1%bsa和0.5%peg20000的0.1m3-(n-嗎啉基)-2-羥基丙磺酸復(fù)溶，得混合標(biāo)記液，混合后的標(biāo)記液與步驟3）熒光微球標(biāo)記雞igy抗體按照重量比20:1混合，用噴金劃膜儀噴至聚酯纖維素膜上，噴量為3μl/cm，放入37℃烘箱，干燥8小時。進一步的，上述的一種pct熒光微球免疫層析檢測試劑卡的制備方法，所述的包被膜的制備方法是反應(yīng)膜上t線位置包被的是抗pct抗體，c線位置包被的是羊抗雞igy。進一步的，上述的一種pct熒光微球免疫層析檢測試劑卡的制備方法，所述的樣品墊的制備方法將樣品墊裁成20mm×300mm的大小，浸泡在樣品墊緩沖液中，1小時之后取出，于室溫干燥16-18小時；所述的樣品墊緩沖液配方如下：2%山梨糖、0.5%s9和0.1mg/ml兔抗人紅細胞抗體溶解于0.2mpbph7.4緩沖液中。進一步的，上述的一種pct熒光微球免疫層析檢測試劑卡的制備方法，所述的熒光微球的固含量1%。進一步的，上述的一種pct熒光微球免疫層析檢測試劑卡的制備方法，所述的保存液為：10%蔗糖、1.5%bsa溶解于0.1mgly-naoh溶液中。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的pct熒光微球免疫層析檢測試劑卡具有如下優(yōu)點：本發(fā)明提供的技術(shù)方案具體檢測時將稀釋后的樣品（血清、血漿、全血）加入樣品墊時，樣品依次透過樣品墊，結(jié)合墊，在毛細管作用樣品將沿著試劑條向吸收墊的方向移動。當(dāng)樣品中含有高濃度pct時，樣品中的pct可同時與偶聯(lián)兩種粒徑（100nm和300nm）熒光微球的抗pct單克隆抗體和包被在nc膜上抗pct單克隆抗體發(fā)生特異結(jié)合，在t1處形成雙抗體夾心結(jié)構(gòu)，此時在t線處的熒光強度為兩種粒徑熒光微球的總和。當(dāng)樣品中pct的濃度低時，樣品中的pct主要與偶聯(lián)300nm粒徑的熒光微球的抗pct單克隆抗體和包被在nc膜上抗pct單克隆抗體發(fā)生特異結(jié)合，在t處形成雙抗體夾心結(jié)構(gòu)，此時在t線處的熒光強度為300nm粒徑熒光微球的熒光；有效解決了粒徑小的熒光微球能檢測出高濃度的pct抗原而在低濃度時無法檢測，粒徑大的熒光微球能檢測出低濃度的抗原，而在高濃度出無法檢測，本發(fā)明提供的技術(shù)方案選擇兩種粒徑微球可以同時檢測出低濃度和高濃度的pct抗原，檢測靈敏度高。附圖說明圖1是本發(fā)明提供的pct熒光微球免疫層析檢測試劑卡結(jié)構(gòu)示意圖。圖2是本發(fā)明提供的pct熒光微球免疫層析檢測試劑卡檢測曲線圖。具體實施方式下面結(jié)合具體實施方式，對本發(fā)明的權(quán)利要求做進一步的限定，但是不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制。實施例1本發(fā)明提供的一種pct熒光微球免疫層析檢測試劑卡，參閱圖1，包括底板1，所述的底板1上依次銜接有樣品墊2、結(jié)合墊3、包被膜4和吸收墊5，所述的結(jié)合墊3噴涂有粒徑為100nm熒光微球標(biāo)記的pct抗體和300nm熒光微球標(biāo)記的pct抗體，以及熒光微球標(biāo)記的雞igy；所述的粒徑為100nm熒光微球和300nm熒光微球的比重為5:1~7:1；所述的包被膜t線位置包被有抗pct抗體，c線位置包被有羊抗雞igy。上述的pct熒光微球免疫層析檢測試劑卡的制備方法：（1）樣品墊的制備方法樣品墊的緩沖液配方如下：2%山梨糖、0.5%s9和0.1mg/ml兔抗人紅細胞抗體溶解于0.2mpb（ph7.4）緩沖液中。（2）結(jié)合墊的制備方法100nm熒光微球標(biāo)記抗pct抗體的步驟在1ml0.1mph6.0的4-羥乙基哌嗪乙磺酸中加入100nm粒徑的熒光微球（固含量1%）和抗pct抗體，兩者比重為1:5~1:20；加入10mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（edc）溶液，室溫反應(yīng)30min，16000rpm離心30min，去上清，加入保存液，超聲混勻。300nm熒光微球標(biāo)記抗pct抗體的步驟在1ml0.1mph6.0的4-羥乙基哌嗪乙磺酸中加入300nm粒徑的熒光微球（固含量1%）和抗pct抗體，兩者比重為1:10~1:50；加入10mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（edc）溶液，室溫反應(yīng)30min。16000rpm離心30min，去上清，加入保存液，超聲混勻。所述的熒光微球標(biāo)記雞igy抗體的步驟為：在1ml0.1mph6.0的4-羥乙基哌嗪乙磺酸中加入熒光微球（固含量1%）和雞igy，兩者比重為1:5~1:20；加入10mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（edc）溶液，室溫反應(yīng)30min。16000rpm離心30min，去上清，加入保存液，超聲混勻。所述的保存液為：10%蔗糖、1.5%bsa溶解于0.1mgly-naoh溶液中。將所制備的100nm、300nm粒徑熒光微球按重量比5:1~7:1混合（優(yōu)選6:1），混合后離心去上清，用添加了0.1%sds、1%bsa和0.5%peg20000的0.1m3-(n-嗎啉基)-2-羥基丙磺酸復(fù)溶，得混合標(biāo)記液，混合后的標(biāo)記液與步驟3）熒光微球標(biāo)記雞igy抗體按照重量比20:1混合，用噴金劃膜儀噴至聚酯纖維素膜上，噴量為3μl/cm，放入37℃烘箱，干燥8小時。（3）包被膜的制備方法為：在檢測線t線將0.01m的pbs（ph7.4含1%的葡萄糖）將抗pct抗體稀釋至1mg/ml，進行畫膜，畫膜參數(shù)為1μl/cm。在檢測線c線將0.01m的pbs（ph7.4含1%的葡萄糖）將羊抗雞igy抗體稀釋至1mg/ml，進行畫膜，畫膜參數(shù)為1μl/cm，再在37℃烘箱干燥，干燥時間16h。上述的pct熒光微球免疫層析檢測試劑卡的組裝方法如下：各組件在底板上的排列順序依次為吸收墊--硝酸纖維素膜--結(jié)合墊--樣品墊①吸收墊的粘貼：將底板平鋪于工作臺面上；揭開底板上緣吸收墊粘貼處的保護膜，將吸收墊粘附于其上，均勻、輕微滾動式推進，以加強粘合力，并防止產(chǎn)生氣泡，吸收墊覆蓋在硝酸纖維素膜上2mm。②結(jié)合墊粘貼：將結(jié)合墊裁為寬15mm×長300mm，揭開硝酸纖維素膜下緣結(jié)合墊粘貼處的保護膜，將結(jié)合墊粘附于其上，方法同吸收墊，結(jié)合墊覆蓋在硝酸纖維素膜上2mm。③樣品墊的粘貼：將樣品墊粘附于結(jié)合墊下部，方法同吸收墊。樣品墊覆蓋在結(jié)合墊上2mm。④試紙條切割：將粘貼好的底板放入切條機中，切成4mm寬的試紙條。⑤裝卡與入袋：將每一試紙條裝入塑料卡內(nèi)，將每一試劑卡置于鋁膜袋中，并加入1g干燥劑1包，熱合封口。pct熒光微球免疫層析檢測試劑卡的具體使用方法：打開儀器，插入與試劑批號相同的芯片；使用時除去試劑卡外包裝，取出試劑卡，水平放置；精確吸取稀釋后75μl血清/血漿，或100μl全血樣品，加入到檢測卡的加樣孔中，然后開始計時；待室溫反應(yīng)10min后，將檢測卡放入到儀器的卡槽中；點擊儀器上的“測試”按鍵，儀器將開始測試，并顯示結(jié)果；點擊“打印”，可打印檢測結(jié)果報告。本發(fā)明型pct的檢測原理如下：將樣品（血清、血漿、全血）加入樣品孔時，樣品依次透過樣品墊，結(jié)合墊，在毛細管作用樣品將沿著試劑條向吸收墊的方向移動。當(dāng)樣品中含有高濃度pct時，樣品中的pct可同時與偶聯(lián)兩種粒徑（100nm和300nm）熒光微球的抗pct單克隆抗體和包被在nc膜上抗pct單克隆抗體發(fā)生特異結(jié)合，在t處形成雙抗體夾心結(jié)構(gòu)。此時在t線處的熒光強度為兩種粒徑熒光微球的總和。當(dāng)樣品中pct的濃度低時，樣品中的pct主要與偶聯(lián)300nm粒徑的熒光微球的抗pct單克隆抗體和包被在nc膜上抗pct單克隆抗體發(fā)生特異結(jié)合，在t處形成雙抗體夾心結(jié)構(gòu),此時在t線處的熒光強度為300nm粒徑熒光微球的熒光。這樣有效避免了在粒徑小的熒光微球能檢測出高濃度的pct抗原而在低濃度時無法檢測，粒徑大的熒光微球能檢測出低濃度的抗原，而在高濃度出無法檢測。選擇一定比例的兩種粒徑微球可以同時檢測出低濃度和高濃度的pct抗原。為了證明本發(fā)明提供的技術(shù)方案的效果，下述試驗例將pct校準(zhǔn)品，稀釋濃度至0.05ng/ml、0.5ng/ml、5ng/ml、50ng/ml、100ng/ml的樣本，使用移液器取75μl的樣本加入加樣孔中，靜置10分鐘后放入熒光檢測儀中讀值。每個樣本濃度檢測三次，取平均值后以樣本濃度值對檢測值作圖，參閱圖2。標(biāo)準(zhǔn)品0ng/ml0.05ng/ml0.5ng/ml5ng/ml50ng/ml100ng/ml檢測t/c值0.0250.0450.171.0210.319.8為了更好的說明本發(fā)明型的有益效果，下面給出采用本發(fā)明型提供的檢測試劑與傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫分析法、膠體金法、熒光免疫層析法在檢測pct時的結(jié)果對比實驗。檢測方法專利公開號檢測限化學(xué)發(fā)光cn106093416a0.05ng/ml膠體金免疫層析cn106093431a0.1ng/ml膠乳增強免疫比濁cn102759631b0.2ng/ml熒光免疫層析cn104714033b0.1ng/ml本發(fā)明提供的方法0.05ng/ml上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁12