本發(fā)明涉及分析化學(xué)中的熒光探針傳感技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種檢測(cè)多硫化物的近紅外熒光探針及其制備方法與應(yīng)用技術(shù)。

背景技術(shù)：

隨著工農(nóng)業(yè)的發(fā)展，多硫化物的大量使用如：作為聚合終止劑，制革工業(yè)中的脫毛劑，農(nóng)業(yè)上用作殺蟲(chóng)劑，石油煉制助劑等。其對(duì)環(huán)境的影響問(wèn)題不容小覷，因此，對(duì)多硫化物的定性定量檢測(cè)十分重要。

另外，活性含硫化合物包括硫化氫、過(guò)硫化氫、巰基氨基酸等在細(xì)胞新陳代謝過(guò)程中扮演著十分重要的作用(蛋白質(zhì)的功能、氧化還原信號(hào)傳遞等)。作為其中一種重要的信號(hào)分子，硫化氫被認(rèn)為是生物系統(tǒng)中第三類(lèi)氣體遞質(zhì)，過(guò)高或過(guò)低的硫化氫含量會(huì)影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)，它與許多重大疾病相關(guān)，例如：唐氏綜合癥、阿爾茨海默病等。然而，近期研究表明，細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞可能是通過(guò)多硫化氫(由生物活性氧氧化硫化氫產(chǎn)生)與硫化氫共同作用下實(shí)現(xiàn)的，并且，多硫化氫能夠比硫化氫更高效地激活腫瘤抑制，離子通道，轉(zhuǎn)錄因子以及具有更高效的硫化作用。然而，對(duì)于多硫化氫在生物功能方面的研究尚處于初期階段，還有很多的問(wèn)題迫切地需要解決。傳統(tǒng)的測(cè)定多硫化的定方法主要是依賴(lài)氣質(zhì)聯(lián)用法，該方法雖然能夠測(cè)定多硫化氫，但是也存在一定的缺陷，例如選擇性差、樣品制備復(fù)雜、操作復(fù)雜、儀器成本昂貴、耗時(shí)、不易普及應(yīng)用。因此，開(kāi)發(fā)一種能夠有效、準(zhǔn)確、便捷地檢測(cè)多硫化氫的方法顯得尤為重要，它不僅具有環(huán)境監(jiān)測(cè)的重要意義，而且對(duì)一些重大疾病的初期臨床診斷具有十分重要的意義。

本發(fā)明涉及一種檢測(cè)多硫化物的近紅外熒光探針及其制備方法與應(yīng)用技術(shù)。我們通過(guò)尼羅紅衍生物與2-氟-4-硝基苯甲酸和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和4-二甲氨基吡啶反應(yīng)，設(shè)計(jì)了這種新型的近紅外熒光探針。該探針在檢測(cè)多硫化氫上體現(xiàn)了其高選擇性，高靈敏度，快速檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)。另外，近紅外熒光在進(jìn)行生物組織或細(xì)胞檢測(cè)時(shí)對(duì)生物機(jī)體損傷小。同時(shí)，生物組織對(duì)近紅外區(qū)熒光的吸收最少，近紅外光可以穿透生物組織的距離大，可以對(duì)深層的組織和器官進(jìn)行探測(cè)和成像。因此，該探針具有潛在的應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種近紅外熒光探針以及探針的制備方法與在檢測(cè)多硫化物中的應(yīng)用。

根據(jù)本發(fā)明，所述通過(guò)帶羥基的尼羅紅衍生物與2-氟-4-硝基苯甲酸反應(yīng)得到探針?lè)肿?，其合成步驟具體包括：(1)在冰浴下，5-二乙胺基-2-亞硝基苯酚鹽酸鹽和1，6-二羥基萘溶于n,n-二甲基甲酰胺溶劑，氬氣保護(hù)下攪拌反應(yīng)，最終得到一種帶羥基的尼羅紅衍生物；(2)將步驟(1)中得到的尼羅紅衍生物與2-氟-4-硝基苯甲酸和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽溶于二氯甲烷中，再加入適量的催化劑，室溫下攪拌反應(yīng)，經(jīng)過(guò)分離提純，最終得到所述的近紅外熒光探針。

與現(xiàn)有技術(shù)相比本專(zhuān)利技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1.選擇性好，抗干擾能力強(qiáng)；

2.靈敏度高，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)微量目標(biāo)物的檢測(cè)；

3.快速響應(yīng)，可實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)；

3.合成簡(jiǎn)單，檢測(cè)方便；

4.近紅外光檢測(cè)，對(duì)生物體損傷小，具有潛在應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1為探針檢測(cè)二硫化鈉的熒光滴定圖

圖2為探針檢測(cè)多硫化物的響應(yīng)時(shí)間熒光光譜圖

圖3為探針的ph優(yōu)化熒光光譜圖

圖4為探針的選擇性實(shí)驗(yàn)熒光光譜圖

具體實(shí)施方式

以下將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，本發(fā)明的實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，并非限定本發(fā)明。

實(shí)施例1

在冰浴下，取5-二乙胺基-2-亞硝基苯酚鹽酸鹽(0.5g，2.6mmol)和1，6-二羥基萘(0.41g，2.6mmol)溶于8ml的n,n-二甲基甲酰胺中，氬氣保護(hù)下140℃回流反應(yīng)5小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束，待反應(yīng)液冷卻至室溫，加入100ml的h2o，二氯甲烷萃取，無(wú)水硫酸鈉干燥，旋干，通過(guò)層析柱分離提純，最終得到帶羥基的尼羅紅衍生物。將該尼羅紅衍生物(110mg，0.33mmol)與2-氟-4-硝基苯甲酸(74mg，0.4mmol)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(126mg，0.66mmol)溶于10ml的二氯甲烷中，再加入催化劑4-二甲氨基吡啶(40mg，0.33mmol)，然后室溫下攪拌反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束，將反應(yīng)液倒入40ml的水中，二氯甲烷萃取，無(wú)水硫酸鈉干燥，旋干，通過(guò)層析柱分離提純最終得到最終產(chǎn)物，即本發(fā)明所述的近紅外熒光探針。

實(shí)施例2

在冰浴下，取5-二乙胺基-2-亞硝基苯酚鹽酸鹽(1.15g，6.0mmol)和1，6-二羥基萘(0.82g，5.2mmol)溶于12ml的n,n-二甲基甲酰胺中，氬氣保護(hù)下140℃回流反應(yīng)8小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束，待反應(yīng)液冷卻至室溫，加入100ml的h2o，二氯甲烷萃取，無(wú)水硫酸鈉干燥，旋干，通過(guò)層析柱分離提純，最終得到帶羥基的尼羅紅衍生物。將該尼羅紅衍生物(330mg，0.99mmol)與2-氟-4-硝基苯甲酸(370mg，2.0mmol)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(530mg，3.3mmol)溶于20ml的二氯甲烷中，再加入催化劑4-二甲氨基吡啶(50mg，0.39mmol)，然后室溫下攪拌反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束，將反應(yīng)液倒入50ml的水中，二氯甲烷萃取，無(wú)水硫酸鈉干燥，旋干，通過(guò)層析柱分離提純最終得到最終產(chǎn)物，即本發(fā)明所述的近紅外熒光探針。

實(shí)施例3

在冰浴下，取5-二乙胺基-2-亞硝基苯酚鹽酸鹽(0.5g，2.6mmol)和1，6-二羥基萘(0.41g，2.6mmol)溶于8ml的n,n-二甲基甲酰胺中，氬氣保護(hù)下140℃回流反應(yīng)3小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束，待反應(yīng)液冷卻至室溫，加入100ml的h2o，二氯甲烷萃取，無(wú)水硫酸鈉干燥，旋干，通過(guò)層析柱分離提純，最終得到帶羥基的尼羅紅衍生物。將該尼羅紅衍生物(110mg，0.33mmol)與2-氟-4-硝基苯甲酸(74mg，0.4mmol)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(126mg，0.66mmol)溶于10ml的二氯甲烷中，再加入催化劑4-二甲氨基吡啶(20mg，0.17mmol)，然后室溫下攪拌反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束，將反應(yīng)液倒入40ml的水中，二氯甲烷萃取，無(wú)水硫酸鈉干燥，旋干，通過(guò)層析柱分離提純最終得到最終產(chǎn)物，即本發(fā)明所述的近紅外熒光探針。

通過(guò)tlc監(jiān)測(cè)得知實(shí)施例1～3中得到的探針是同一種物質(zhì)，通過(guò)核磁表征，證明該探針的成功制備，表征數(shù)據(jù)如下：¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ9.10-9.07(q,1h),8.56-8.52(m,2h),8.42(d,j＝8.0hz,1h),7.60(d,j＝8.0hz,1h),7.54-7.51(q,1h),7.45(t,j＝9.2hz,1h),6.70-6.67(q,1h),6.49(d,j＝2.8hz,1h),6.41(s,1h),3.51-3.46(q,4h),1.27(t,j＝7.2hz,6h).¹³cnmr(100mhz,cdcl3)δ182.6,166.9,164.1,160.3,152.5,151.1,147.0,138.8,133.9,131.4,130.5,130.3,130.0,128.7,127.9,125.0,123.1,118.9,118.7,116.3,110.0,105.6,96.3,45.2,12.6.

應(yīng)用實(shí)例1：如圖1，探針檢測(cè)二硫化鈉的熒光滴定圖。在二甲基亞砜與水的混合溶液中加入探針(5μm)，在波長(zhǎng)550nm的光激發(fā)下探針本身的熒光非常弱。當(dāng)探針與二硫化鈉響應(yīng)之后，在近紅外區(qū)655nm處的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，并隨著二硫化鈉濃度的增加熒光強(qiáng)度也隨之不斷的增加，呈良好的線性關(guān)系。證明該探針可以很好的應(yīng)用于二硫化鈉的檢測(cè)。

應(yīng)用實(shí)例2：如圖2，探針檢測(cè)二硫化鈉的響應(yīng)時(shí)間熒光譜圖。在二甲基亞砜與水的混合溶液中加入探針(5μm),在波長(zhǎng)550nm的光激發(fā)下探針本身的熒光非常弱，但加入二硫化鈉之后，在近紅外區(qū)655nm處的熒光強(qiáng)度開(kāi)始逐漸增強(qiáng)，并在6分鐘之內(nèi)完全響應(yīng)，熒光強(qiáng)度不再變化。以此證明該探針具有實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)二硫化鈉的性能。

應(yīng)用實(shí)例3：如圖3，探針的ph優(yōu)化熒光譜圖。在二甲基亞砜與水的混合溶液(調(diào)節(jié)ph,使其溶液的ph值分別為3～10)中加入探針(5μm)和目標(biāo)物二硫化鈉，保持其他的測(cè)試條件不變，測(cè)得不同ph下探針響應(yīng)二硫化鈉的情況，由圖可知，ph＝5～10之間探針均能保持很好的穩(wěn)定性，能很好地響應(yīng)二硫化鈉。

應(yīng)用實(shí)例4：如圖4，探針的選擇性實(shí)驗(yàn)熒光光譜圖。在相同的測(cè)試體系和測(cè)試條件下分別加入不同的干擾物(1～29分別為：探針本身、hco3^-、br^-、hpo4^2-、i^-、no3^-、no2^-、h2po4^-、ac^-、k⁺、thr、mg²⁺、zn²⁺、pro、so4^2-、gly、ca²⁺、na⁺、trp、arg、ala、na2s2o3、hcy、so3^2-、gsh、cys、s^2-、hs^-、na2s2)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，探針的選擇性非常好，探針不與這些干擾物響應(yīng)，熒光強(qiáng)度幾乎不變。只有當(dāng)溶液中存在二硫化鈉時(shí)，探針才與其快速響應(yīng)，并且表現(xiàn)出近紅外區(qū)655nm處的熒光強(qiáng)度極大增強(qiáng)。體現(xiàn)出了該探針對(duì)檢測(cè)二硫化鈉的高選擇性。