本發(fā)明屬于生物材料檢測領(lǐng)域，具體涉及一種可同時檢測氯化汞和溴化汞的方法。

背景技術(shù)：

鹵族高汞化合物包括氯化汞和溴化汞，均為無機(jī)劇毒物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)均有相似之處。其中，氯化汞，俗稱升汞，是分析化學(xué)的重要試劑，同時可用于木材和解剖標(biāo)本的保存、皮革鞣制和鋼鐵鏤蝕等，在工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。溴化汞，也是藥物分析試驗(yàn)中常用的化學(xué)試劑。氯化汞和溴化汞均屬于無機(jī)劇毒物品范疇，可通過呼吸道、消化道或皮膚吸收。實(shí)際生產(chǎn)中常有因防護(hù)措施不到位而引起的中毒案例報道。職業(yè)中毒主要是經(jīng)呼吸道吸入金屬汞蒸氣或汞化合物氣溶膠所致。

常規(guī)測定氯化汞的方法多為原子熒光光譜法和冷原子吸收光譜法測定生物樣品中總汞的含量，需要經(jīng)過高壓消解或微波消解步驟，通常需要3-4小時，耗時過長且程序繁瑣，不適用于臨床急救檢驗(yàn)。

發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，可通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測生物檢材中的氯化汞（《氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測生物檢材中的氯化汞》，中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2016，vo.l26,no.17）,但是該方法具有很大的局限性：1、只對樣品中的氯化汞進(jìn)行檢測，不能對溴化汞同時進(jìn)行檢測；2、定量限較高，最低定量限為5μg/g，靈敏度有待進(jìn)一步提高；3、氯化汞和溴化汞的分離度未達(dá)到要求，二者不能實(shí)現(xiàn)分離，因而不能分別檢測；4、不適用檢測血漿樣品中的氯化汞和溴化汞。

因此，研制開發(fā)一種可同時檢測氯化汞和溴化汞的方法一直是亟待解決的新課題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種同時檢測生物材料中氯化汞和溴化汞的方法，通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，能夠有針對性的檢測出生物樣品中的氯化汞和溴化汞，而不是僅僅檢測生物樣品中總汞的含量，提高了檢測的靈敏度，同時大大簡化了檢測步驟，節(jié)省了時間和成本。

本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：一種可同時檢測氯化汞和溴化汞的方法，其特征在于。

該方法包括如下步驟。

（1）檢測條件。

氣質(zhì)聯(lián)用儀：采用7890b-5977a氣質(zhì)聯(lián)用儀。

色譜柱：hp-5ms毛細(xì)管柱，規(guī)格：30m×0.25mm，0.25μm。

電子離子轟擊源(ei源，70ev)，全離子掃描，掃描質(zhì)量范圍為40amu～600amu。

載氣為高純氦氣(99.9%)，流速1.0ml/min。

升溫程序:初始柱溫為60℃，保持1min，以15℃/min升溫至180℃,保持8min，再以30℃/min升溫至260℃,進(jìn)樣口溫度為265℃，離子源溫度為230℃。

（2）樣品處理。

取生物材料0.5g，加入skf-525a內(nèi)標(biāo)物500ng，加入0.01mol/l鹽酸溶液1ml，用2ml乙酸乙酯渦旋混合提取，3500r/min離心10min，吸取上清液，常溫下氮?dú)獯蹈?，?0μl乙酸乙酯復(fù)溶，取1μl進(jìn)樣分析。

（3）氯化汞和溴化汞儲備液的配制。

氯化汞標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1.0mg/ml）：精密稱取0.1354g經(jīng)干燥的氯化汞，用重鉻酸鉀的硝酸溶液（0.5g/l）溶解，并轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中，稀釋至刻度，混勻，于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

溴化汞標(biāo)準(zhǔn)儲備液（50.0mg/ml）：取溴化汞2.5g，加乙醇50ml，微熱使溶解，即得。本液應(yīng)置玻璃塞瓶內(nèi)，在暗處保存。

(4)圖譜分析。

氯化汞和溴化汞的保留時間均在8min左右，氯化汞譜圖中m/z272為分子離子峰，m/z237為失去一個氯離子的碎片離子峰，m/z202為失去兩個氯離子的碎片離子峰。

溴化汞譜圖中m/z360為分子離子峰，m/z281為失去一個溴離子的碎片離子峰，m/z202為失去兩個溴離子的碎片離子峰，m/z79為單一溴離子的碎片離子峰。

（5）含量計算。

向生物材料中添加氯化汞和溴化汞儲備液，制成標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，以氯化汞和溴化汞的峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積之比為縱坐標(biāo)，以氯化汞和溴化汞的濃度為橫坐標(biāo)，分別計算回歸方程；計算含量時，將待測樣品中氯化汞或溴化汞的峰面積代入回歸方程即得到待測樣品含量。

該檢測方法所使用的生物材料為尿液、胃內(nèi)容物或血漿樣品。

該方法的最低檢出限以s/n=3進(jìn)行計算，對于氯化汞的最低檢出限為0.2μg/g，該方法對于溴化汞的最低檢出限為0.5μg/g。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下有益效果。

1、常規(guī)測定生物檢材中汞的方法多為原子熒光光譜法和冷原子吸收光譜法，僅僅檢測生物樣品中總汞的含量，不能夠有針對性的檢測出生物樣品中的氯化汞和溴化汞。本專利不僅簡化了檢測步驟，提高了檢測的靈敏度?？赏瑫r檢測氯化汞和溴化汞，并進(jìn)行定量分析。

2、本發(fā)明采用液液萃取方法，通過篩選不同的提取溶劑，調(diào)節(jié)不同的ph值，以及調(diào)整不同的離子濃度。使定量限降低，靈敏度提高，最低檢出限以s/n=3進(jìn)行計算，對于氯化汞的最低檢出限為0.2μg/g，該方法對于溴化汞的最低檢出限為0.5μg/g。

3、本發(fā)明調(diào)整了氣相色譜的程序升溫模式，使目標(biāo)物質(zhì)的峰形更加尖銳，提高了氯化汞和溴化汞的分離度，能夠?qū)崿F(xiàn)分別檢測。

4、可檢測的生物材料包括尿液、胃內(nèi)容物或血漿樣品。

附圖說明

圖1為不同ph值對氯化汞和溴化汞提取回收率的影響圖。

圖2為不同升溫程序?qū)β然弯寤蛛x效果的影響圖，a：使用本發(fā)明的升溫程序，b：使用對比文獻(xiàn)的升溫程序。

圖3為實(shí)施例二氯化汞、溴化汞和內(nèi)標(biāo)的選擇離子監(jiān)測色譜圖。

圖4為實(shí)施例二氯化汞和溴化汞的質(zhì)譜圖，a：氯化汞質(zhì)譜圖；b：溴化汞質(zhì)譜圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例一。

1、不同提取溶劑的篩選。

為了提高氯化汞和溴化汞的提取回收率，本發(fā)明考察了不同極性的提取溶劑對氯化汞和溴化汞提取回收率的影響。

實(shí)驗(yàn)過程如下：分別取三份空白尿液各0.5g，加入等量的氯化汞和溴化汞標(biāo)準(zhǔn)儲備液，加入skf-525a內(nèi)標(biāo)物500ng，加入0.01mol/l鹽酸溶液1ml，分別用2ml乙酸乙酯、2ml二氯甲烷和2ml環(huán)己烷渦旋混合提取，3500r/min離心10min，吸取上清液，常溫下氮?dú)獯蹈?，?0μl乙酸乙酯復(fù)溶，取1μl進(jìn)樣分析。分別計算氯化汞和溴化汞的提取回收率。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1,結(jié)果可知乙酸乙酯為溶劑時提取效率最高。

2、不同ph值對提取回收率的影響。

實(shí)驗(yàn)考察了不同ph值對提取回收率的影響。

實(shí)驗(yàn)過程如下：分別取三份空白尿液各0.5g，加入等量的氯化汞和溴化汞標(biāo)準(zhǔn)儲備液，加入skf-525a內(nèi)標(biāo)物500ng，分別在檢材中加入1ml0.01m的鹽酸溶液，1ml蒸餾水和1ml0.01m的氫氧化鈉溶液，使ph值分別為酸性ph=2、中性ph=7和堿性ph=12，用2ml乙酸乙酯渦旋混合提取，3500r/min離心10min，吸取上清液，常溫下氮?dú)獯蹈?，?0μl乙酸乙酯復(fù)溶，取1μl進(jìn)樣分析。分別計算氯化汞和溴化汞的提取回收率。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1,經(jīng)計算在酸性條件下回收率最高?？芍谒嵝詶l件下氯化汞和溴化汞能更好地以分子形式存在，故本發(fā)明加入0.01mol/l鹽酸溶液。

3、不同離子強(qiáng)度對提取回收率的影響。

實(shí)驗(yàn)考察了離子強(qiáng)度對提取回收率的影響。

實(shí)驗(yàn)過程如下：分別取2分空白尿液各0.5g，加入等量的氯化汞和溴化汞標(biāo)準(zhǔn)儲備液，加入skf-525a內(nèi)標(biāo)物500ng，分別在檢材中加入1ml蒸餾水和1ml飽和氯化鈉溶液，使溶液呈現(xiàn)不同的離子強(qiáng)度，用2ml乙酸乙酯渦旋混合提取，3500r/min離心10min，吸取上清液，常溫下氮?dú)獯蹈?，?0μl乙酸乙酯復(fù)溶，取1μl進(jìn)樣分析。分別計算氯化汞和溴化汞的提取回收率。

結(jié)果表明，加入飽和氯化鈉溶液后，不能從檢材中提取出氯化汞和溴化汞。分析原因可能是離子強(qiáng)度的改變影響了氯化汞和溴化汞的分子結(jié)構(gòu)，使其不能被提取分離出來。

4、不同升溫程序?qū)τ诜蛛x效果的影響。

為了比較不同的升溫程序?qū)τ诼然弯寤姆蛛x效果，采用了不同的程序升溫，其余檢測方法相同。

a組：本發(fā)明的升溫程序，初始柱溫為60℃，保持1min，以15℃/min升溫至180℃保持8min，再以30℃/min升溫至260℃。

b組：對比文獻(xiàn)（《氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測生物檢材中的氯化汞》，中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2016，vo.l26,no.17）中的升溫程序：初始柱溫為60℃，保持1min，以20℃/min升溫至260℃。

結(jié)果表明，本發(fā)明升溫條件下氯化汞和溴化汞實(shí)現(xiàn)基線分離氯化汞和溴化汞的分離度明顯提升，色譜圖上兩峰達(dá)到基線分離，能夠?qū)崿F(xiàn)同時檢測；而對比文獻(xiàn)條件下氯化汞與溴化汞不能完全分離，見圖2。

實(shí)施例二。

（1）檢測條件。

氣質(zhì)聯(lián)用儀：采用aglient公司生產(chǎn)的7890b-5977a氣質(zhì)聯(lián)用儀。

色譜柱：hp-5ms毛細(xì)管柱，規(guī)格：30m×0.25mm，0.25μm；

電子離子轟擊源(ei源，70ev)，全離子掃描，掃描質(zhì)量范圍為40amu～600amu。

載氣為高純氦氣(99.9%)，流速1.0ml/min。

升溫程序:初始柱溫為60℃，保持1min，以15℃/min升溫至180℃,保持8min，再以30℃/min升溫至260℃,進(jìn)樣口溫度為265℃，離子源溫度為230℃。

（2）樣品處理。

取人體尿液0.5g，加入skf-525a內(nèi)標(biāo)物500ng，加入0.01mol/l鹽酸溶液1ml，用2ml乙酸乙酯渦旋混合提取，3500r/min離心10min，吸取上清液，常溫下氮?dú)獯蹈桑?0μl乙酸乙酯復(fù)溶，取1μl進(jìn)樣分析。

（3）氯化汞和溴化汞儲備液的配制。

氯化汞標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1.0mg/ml）：精密稱取0.1354g經(jīng)干燥的氯化汞，用重鉻酸鉀的硝酸溶液（0.5g/l）溶解，并轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中，稀釋至刻度，混勻，于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

溴化汞標(biāo)準(zhǔn)儲備液（50.0mg/ml）：取溴化汞2.5g，加乙醇50ml，微熱使溶解，即得。本液應(yīng)置玻璃塞瓶內(nèi)，在暗處保存。

(4)圖譜分析。

氯化汞和溴化汞的保留時間均在8min左右，氯化汞譜圖中m/z272為分子離子峰，m/z237為失去一個氯離子的碎片離子峰，m/z202為失去兩個氯離子的碎片離子峰。

溴化汞譜圖中m/z360為分子離子峰，m/z281為失去一個溴離子的碎片離子峰，m/z202為失去兩個溴離子的碎片離子峰，m/z79為單一溴離子的碎片離子峰。

（5）含量計算。

向人體尿液中添加氯化汞和溴化汞儲備液，制成標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，以氯化汞和溴化汞的峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積之比為縱坐標(biāo)，以氯化汞和溴化汞的濃度為橫坐標(biāo)，分別計算回歸方程；計算含量時，將待測樣品中氯化汞或溴化汞的峰面積代入回歸方程即得到待測樣品含量。尿中氯化汞標(biāo)準(zhǔn)工作曲線為y=0.0003x+4e-05，相關(guān)系數(shù)（r）為0.9991，氯化汞的濃度為0.2μg/g~20μg/g時，線性關(guān)系良好；尿中溴化汞的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線為y=0.0002x+2e-05，相關(guān)系數(shù)（r）為0.9993，溴化汞的濃度為0.5μg/g~50μg/g時，線性關(guān)系良好。

含量計算：取待測尿液0.5g，加入skf-525a內(nèi)標(biāo)物500ng，加入0.01mol/l鹽酸溶液1ml，用2ml乙酸乙酯渦旋混合提取，3500r/min離心10min，吸取上清液，常溫下氮?dú)獯蹈?，?0μl乙酸乙酯復(fù)溶，取1μl進(jìn)樣分析。記錄氯化汞的峰面積為20453，溴化汞的峰面積為30100，內(nèi)標(biāo)的峰面積為24435114。代入標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得到氯化汞含量為2.66μg/g，溴化汞的含量為6.05μg/g。

實(shí)施例三。

取待測血漿0.5g，按照上述方法測定血漿中氯化汞含量為1.34μg/g，溴化汞的含量為2.76μg/g。

實(shí)施例四。

取待測胃內(nèi)容物0.5g，按照上述方法測定血漿中氯化汞含量為8.86μg/g，溴化汞的含量為10.48μg/g。

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。