本發(fā)明涉屬于食品安全檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種快速鑒別蜂蜜中摻入大米糖漿的核磁共振波譜方法。
背景技術(shù)：
：蜂蜜是由蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物結(jié)合后，經(jīng)充分釀造而成的天然甜物質(zhì)，是一種營養(yǎng)豐富的天然滋養(yǎng)食物。我國蜂蜜國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，不得在蜂蜜中添加或混入任何淀粉類、糖類或代糖類物質(zhì)。近年來，國內(nèi)和國際市場對(duì)蜂蜜的需求量不斷擴(kuò)大，然而蜂蜜的產(chǎn)量難以滿足市場的需求。在巨大經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使下，很多不法分子在蜂蜜中摻入大米糖漿、甜菜糖漿、甘蔗糖漿、木薯糖漿、果葡糖漿等甜味物質(zhì)以假亂真，從中牟取高額的利潤。這些摻假蜂蜜盡管在技術(shù)指標(biāo)上符合國家標(biāo)準(zhǔn)，但其不具有天然蜂蜜的全部營養(yǎng)成分，這極大的損害了蜂農(nóng)，消費(fèi)者和正規(guī)蜂蜜生產(chǎn)企業(yè)的利益，嚴(yán)重影響了蜂蜜產(chǎn)品的市場秩序和我國蜂蜜產(chǎn)品的出口貿(mào)易。如何鑒別蜂蜜的好壞與摻假問題，已經(jīng)成為人們普遍關(guān)心的問題。目前，國家也制定了相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)蜂蜜摻假進(jìn)行有效判斷，以保障消費(fèi)者合法權(quán)益。通過檢測(cè)標(biāo)志物smr，可以有效判斷蜂蜜中是否加入大米糖漿,smb-bs可以有效鑒別蜂蜜中是否摻入甜菜糖漿,tlc是測(cè)定高果淀粉糖漿的有效方法。高效液相色譜示差折光法測(cè)定蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖含量以判斷蜂蜜中糖是否符合國家標(biāo)準(zhǔn)。碳同位素質(zhì)譜法對(duì)于鑒定天然蜂蜜產(chǎn)品中是否摻入碳4植物的糖漿很有效。由于糖漿工藝的千變?nèi)f化，這些方法經(jīng)過一段時(shí)間的運(yùn)用后，往往不再能夠滿足新型工藝糖漿的摻假。比如，smr方法已經(jīng)不能夠滿足新的大米糖漿的摻假。核磁共振技術(shù)(nuclearmagneticresonance,nmr)具有如下特點(diǎn)：樣品預(yù)處理簡單，無需預(yù)篩選，可以避免由于分離所造成的微小成分的丟失；無損傷性，不會(huì)破壞樣品的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，可以進(jìn)行實(shí)時(shí)和動(dòng)態(tài)的檢測(cè)；譜圖中信號(hào)的相對(duì)強(qiáng)弱直接反映了樣品中各組分的相對(duì)含量；以其快速性、無破壞性、可重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用復(fù)雜成分的定性定量檢測(cè)上。本發(fā)明將核磁共振方法用于大米糖漿的快速檢測(cè)，該方法靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)速度快。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了一種快速鑒別蜂蜜中摻入大米糖漿的核磁共振波譜方法為了解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是這樣的，一種快速鑒別蜂蜜中摻入大米糖漿的核磁共振波譜方法，包括如下步驟，1)將攪拌均勻的蜂蜜樣品，濾布過濾，除去蜂蜜中固體雜質(zhì)后，用重水配置成0.03-0.5g/l的溶液；所述的蜂蜜樣品為荊條蜜、油菜蜜和洋槐蜜；2)取一定體積的上述溶液，加入濃度為0.5-2.0mol/l的磷酸鹽緩沖溶液，兩者的體積比為800-1500：100-300，其中，磷酸鹽緩沖溶液中含體積分?jǐn)?shù)為0.05-0.3％的3-三甲基硅烷基-1-丙基磺酸鈉內(nèi)標(biāo)溶液和0.1-3.0mm的疊氮化鈉，渦旋振蕩至均勻混合，調(diào)整最終溶液的ph值為2.5-4.0，置于核磁管中；3)將核磁管放置于核磁共振譜儀中，檢測(cè)得到核磁共振譜；核磁共振波譜的分析條件為：采用bbi探頭；測(cè)定溫度:室溫20-35℃；環(huán)境濕度:20-35％；觀察頻率400mhz；采用預(yù)飽和方法壓制水峰；脈沖程序?yàn)椋簄oesygppr1d或者zg30或者zgpr；譜寬:6410hz；90°脈沖寬度:pl＝6.45μs；脈沖延遲時(shí)間:dl＝15s；發(fā)射中心:o1＝4.7；累加次數(shù):16或者64；4)分析蜂蜜樣品標(biāo)記物化學(xué)位移，含有1h化學(xué)位移δ為2.98±0.02-0.05ppm、2.93±0.02-0.05ppm、2.82±0.02-0.05ppm和2.78±0.02-0.05ppm的四個(gè)單峰，且四個(gè)單峰相對(duì)峰強(qiáng)度為1:1.7:1.7:1，相對(duì)強(qiáng)度誤差范圍不超過10％時(shí)，則可判斷該樣品中摻入了大米糖漿，否則沒有。優(yōu)選地，對(duì)于結(jié)晶的蜂蜜樣品，攪拌均勻前，在密閉情況下，置于不超過40-60℃的水浴中溫?zé)?，振蕩，待樣品全部融化，攪拌均勻后，再迅速冷卻至室溫。優(yōu)選地，蜂蜜樣品過濾采用孔徑為0.10mm-0.14mm的尼龍濾布。優(yōu)選地，步驟2)調(diào)整最終溶液的ph值所采用的濃度為1.0mol/l的鹽酸或強(qiáng)氧化鈉。本方法對(duì)于蜂蜜中所摻入的大米糖漿最低檢出量為10％w/w。有益效果：分析時(shí)間短、選擇性好、完整性強(qiáng)、專屬性好、可控性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)，可以彌補(bǔ)目前蜂蜜摻入大米糖漿鑒別方法存在的缺陷。本研究的實(shí)施對(duì)推動(dòng)行業(yè)科技進(jìn)步、規(guī)范蜂產(chǎn)品市場、保障消費(fèi)者合法權(quán)益以及促進(jìn)我國蜂產(chǎn)品事業(yè)的健康發(fā)展有著十分重要的意義。附圖說明圖1為河南油菜的核磁譜圖；圖2為大米糖漿的核磁譜圖；圖3為河南油菜蜂蜜中摻入10％大米糖漿的核磁譜圖。具體實(shí)施方式為了加深對(duì)本發(fā)明的理解，下面將結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳述，該實(shí)施例僅用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。儀器和設(shè)備實(shí)驗(yàn)設(shè)備包括：advance400型核磁共振儀(瑞士布魯克公司)，14.1t超導(dǎo)磁體，5mm雙核z-梯度探頭及topspin2.3試驗(yàn)控制及數(shù)據(jù)處理軟件；5mm核磁共振樣品管；高速離心機(jī)(sigma，德國公司)；渦旋混合器(xw-80a型，上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠)；lp403分析天平(賽多利斯，德國公司)；實(shí)驗(yàn)溶劑包括：氘代水(氘帶度為99.8％，又名重水)購于cambridegisotopelaboratories公司；3-三甲基硅烷基-1-丙基磺酸鈉(tspsa)購于aldich-sigma公司；磷酸氫二鉀和磷酸二氫鈉(優(yōu)級(jí)純)購于aldich-sigma公司。1.大米糖漿標(biāo)志物的確證1.1樣品的前處理分別選取純大米糖漿、純蜂蜜和摻入10％大米糖漿的蜂蜜作為實(shí)驗(yàn)樣品，其中，蜂蜜為河南油菜蜂蜜，對(duì)于樣品中對(duì)無結(jié)晶的，過濾前將其攪拌均勻即可，而對(duì)有結(jié)晶的，在密閉情況下，置于不超過60℃的水浴中溫?zé)?，振蕩，待樣品全部融化后攪勻，迅速冷卻至室溫；將融化后的蜂蜜樣品，經(jīng)0.10mm-0.14mm孔徑尼龍濾布過濾，除去蜂蜜中固體雜質(zhì)。取0.1g樣品于離心管中，加入1ml重水，溶解完全；取上述溶液800μl，加入100μl濃度為0.5mol/l的磷酸鹽緩沖溶液(ph＝2.0)，其中緩沖溶液中含體積分?jǐn)?shù)為0.05％的3-三甲基硅烷基-1-丙基磺酸鈉內(nèi)標(biāo)溶液和0.1mm的疊氮化鈉，渦旋振蕩至均勻混合，然后用1.0mol/l的鹽酸和強(qiáng)氧化鈉，調(diào)整最終溶液的ph值為2.5，取其中600μl于核磁管中。1.2核磁指紋圖譜數(shù)據(jù)庫的建立調(diào)整好核磁波譜儀并把核磁管放置于核磁共振波譜儀中，旋轉(zhuǎn)核磁管以備1hnmr測(cè)試，得到樣品的核磁信號(hào)；采用bbi探頭；測(cè)定溫度(探頭溫度):室溫20-35℃；環(huán)境濕度:20-35％；觀察頻率400mhz，利用d2o進(jìn)行鎖場，采用預(yù)飽和方法壓制水峰；脈沖程序?yàn)椋簄oesygppr1d或者zg30或者zgpr；譜寬:6410hz；90°脈沖寬度:pl＝6.45μs；脈沖延遲時(shí)間:dl＝15s；發(fā)射中心:o1＝4.7；累加次數(shù):16或者64。1.3譜圖預(yù)處理用核磁共振譜儀自帶的數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)所得的核磁共振信號(hào)進(jìn)行傅立葉變得換，變換點(diǎn)數(shù)為131072，指數(shù)線寬因子為1hz，得到樣品的核磁圖譜。用topspin軟件(topspin軟件中各參數(shù)設(shè)置如下：pulprog＝j(luò)resgpprqf，aq_mod＝dqd,td＝32k,ns＝8*n,ds＝4,td0＝1,sw＝6000hz,d1＝3s,de＝4μs,d8＝0.1s,信號(hào)累加16次)將獲得的原始指紋圖譜進(jìn)行預(yù)處理，包括譜峰對(duì)齊、基線校正和相位校正。以3-三甲基硅烷基-1-丙基磺酸鈉做內(nèi)標(biāo)物，化學(xué)位移設(shè)為0.00進(jìn)行譜峰對(duì)齊；基線校正選擇polynomialfit擬合方式；相校正選擇global和metabonomics算法先自動(dòng)優(yōu)化，后針對(duì)特定區(qū)域進(jìn)行手動(dòng)校正，使盡可能多的積分值為正值；所得的河南油菜蜂蜜、大米糖漿和摻入10％大米糖漿的河南油菜蜂蜜的核磁共振圖譜，如圖1、圖2和圖3所示。1、4核磁共振譜圖的比較分析通過比較研究純蜂蜜和純大米糖漿樣品的核磁共振譜圖，發(fā)現(xiàn)被檢測(cè)的大米糖漿樣品中含有1h化學(xué)位移δ為3.0ppm～2.7ppm之間的四個(gè)單峰，化學(xué)位移分別為2.98ppm、2.93ppm、2.82ppm和2.78ppm，且四個(gè)譜峰的相對(duì)高度比為1:1.7:1.7:1，而純蜜種樣品在此化學(xué)位移處均無干擾。通過比較研究摻入10％大米糖漿的蜂蜜樣品的核磁共振譜圖，發(fā)現(xiàn)檢測(cè)的摻入10％大米糖漿的蜂蜜樣品中也含有1h化學(xué)位移δ分別為2.98ppm、2.93ppm、2.82ppm和2.78ppm的四個(gè)單峰。為了確證所找的大米糖漿標(biāo)志物的準(zhǔn)確性，自行采集的內(nèi)蒙葵花、新疆葵花、遼寧洋槐、河南洋槐、山東洋槐、河南荊條、湖北荊條、江蘇油菜、新疆油菜、四川油菜、新疆棉花、陜西棗花、吉林鍛樹、內(nèi)蒙蕎麥等共計(jì)110個(gè)天然蜂蜜進(jìn)行檢測(cè)，分析發(fā)現(xiàn)在化學(xué)位移2.98ppm、2.93ppm、2.82ppm和2.78ppm處均無干擾，說明結(jié)果表明，所找的大米糖漿標(biāo)志物在所有純蜂蜜中都無干擾，天然蜂蜜中不存在大米糖漿特征物；通過在不同的蜜源蜂蜜中添加不同濃度的大米糖漿來確證最終的大米糖漿標(biāo)志物，最終確定為1h化學(xué)位移δ為1h化學(xué)位移δ為3.0ppm～2.7ppm之間的四個(gè)單峰，這幾個(gè)譜峰是大米糖漿顯著區(qū)別與純蜂蜜的特征性差異物質(zhì)，可以使用這四個(gè)譜峰作為大米糖漿的特征標(biāo)志物，同時(shí)通過蜂蜜中添加不同濃度的大米糖漿蜂蜜樣品的檢測(cè)，確認(rèn)了蜂蜜中所摻入的大米糖漿最低檢出量為10％。2.實(shí)際樣品檢測(cè)運(yùn)用建立的鑒別蜂蜜中大米糖漿的快速鑒別方法用于對(duì)未知蜂蜜樣品進(jìn)行檢測(cè)，將待鑒別的50份蜂蜜樣品按1.1-1.3步驟進(jìn)行操作，獲得所有未知蜂蜜樣品的核磁共振譜圖，依據(jù)找到的大米糖漿標(biāo)記物對(duì)未知蜂蜜樣品進(jìn)行判斷。大米糖漿中的標(biāo)記物化學(xué)位移為：2.98ppm、2.93ppm、2.82ppm和2.78ppm。在相同的實(shí)驗(yàn)條件下檢測(cè)的樣品與標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中大米糖漿標(biāo)志物的化學(xué)位移△δ在0.02-0.05ppm范圍以內(nèi)，所選擇的4個(gè)單譜峰都出現(xiàn)，且相對(duì)峰強(qiáng)度為1:1.7:1.7:1，相對(duì)強(qiáng)度誤差范圍不超過10％。依據(jù)此可以快速判斷樣品屬于純蜂蜜還是摻入大米糖漿的摻假蜂蜜。具體結(jié)果如表1所示，50個(gè)樣品中20個(gè)純蜂蜜樣品和30個(gè)假蜂蜜都得到了正確分類，鑒別正確率為100％。表1樣品類型真實(shí)結(jié)果檢出結(jié)果真實(shí)蜂蜜樣品(20個(gè))陰性陰性大米糖漿樣品(10個(gè))陽性陽性摻入不同比例大米糖漿樣品(20個(gè))陽性陽性以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁12