本實用新型屬于免疫化學檢測技術領域，具體涉及一種嘔吐毒素直接競爭ELISA試劑盒。

背景技術：

嘔吐毒素（vomitoxin）又名脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON），具有很強的細胞毒性，可導致動物腸功能紊亂，口腔黏膜和真皮損傷，免疫力下降。人和牲畜誤食被毒素污染的糧谷后產生廣泛的毒性效應，可引起嘔吐、拒食、體重減輕等癥狀，免疫和造血系統(tǒng)受到損害，還具有很強的皮膚毒性和細胞毒性，嚴重時可損害造血系統(tǒng)造成死亡。DON多分布于小麥、大麥、玉米等谷物籽實中，是在黃曲霉毒素之后污染最嚴重的真菌毒素。由于DON的危害嚴重，引起了各國的普遍重視，相繼制定了谷物及飼料中DON殘留量的嚴格限量標準。我國谷物、豬配合飼料、犢牛配合飼料、泌乳期動物配合飼料中DON的限量標準為1.0mg/kg，牛配合飼料、家禽配合飼料中DON的限量標準為5.0mg/kg。

DON殘留檢測的傳統(tǒng)方法有微生物學法，熒光法，薄層色譜法( TLC)，高效液相色譜法（HPLC），以及液質聯(lián)用法（LC-MS），氣質聯(lián)用檢測法（GC-MS）和液相色譜－串聯(lián)質譜法（LC-MS/MS）等方法。這些方法靈敏度高，定性準確，可以確定化合物的分子量、分子式，甚至官能團，適合定量檢測該化合物及其代謝物。但這些方法成本高，需要專業(yè)的技術人員，昂貴的實驗儀器及長時間的前期準備工作。而免疫學檢測方法建立在抗體對抗原的分子識別上，其主要優(yōu)點是親合力高、快速、簡單、經濟實用，能夠實現(xiàn)對生物液體的小體積、大通量檢測，逐漸成為世界各國有毒有害殘留物快速檢測的方法之一。

因此，研制快速、靈敏、高效的嘔吐毒素直接競爭ELISA試劑盒對于保障動物性食品安全具有十分重要的意義。

技術實現(xiàn)要素：

本實用新型解決的技術問題是提供了一種小巧輕便的嘔吐毒素直接競爭ELISA試劑盒，使用該試劑盒操作簡便，靈敏度高，成本低，穩(wěn)定性好，檢測步驟少，檢測時間短，可進行一次連續(xù)多個樣品中嘔吐毒素含量的測定，減少了樣品檢測所需要的時間。

本實用新型為解決上述技術問題采用如下技術方案，一種嘔吐毒素直接競爭ELISA試劑盒，包括盒體、連接于盒體一側的盒蓋、設置于盒體內側底部的固定座及設置于盒體內部的酶標板、微吸管、離心管、比色卡、說明書和蓋板膜，其特征在于：所述的酶標板由聚苯乙烯制成，采用96孔試劑板作為固相載體，放于鋁鉑袋內，并且酶標板由外框支撐架和放置其上的可拆裝酶標反應微孔條組成，每個可拆裝酶標反應微孔條有12個反應孔，其上預包被抗嘔吐毒素單克隆抗體；所述的微吸管有四種不同容量，其中1.0mL容量的微吸管30根用于樣品基質的采樣，100μL容量的微吸管10根用于添加終止液，50μL容量的微吸管20根用于添加酶標二抗工作液，30μL容量的微吸管40根用于添加底物顯色劑A液和底物顯色劑B液；所述的離心管有三種不同容量，分別為10mL、5mL和1.5mL，用于樣品采集和基質前處理；所述的比色卡有5張，顯示不同顏色試劑孔對應的吸光度值，用于水樣、奶制品、茶葉、飼料和食品中嘔吐毒素殘留含量的推算；所述的說明書用于介紹試劑盒的原理、標準曲線、適用范圍、交叉反應率、所需儀器和試劑、使用方法和注意事項；所述的蓋板膜5張，用于樣品檢測時覆蓋酶標板以防止液體蒸發(fā)影響檢測結果；所述的固定座上設有12個試劑瓶下凹瓶位和2個備用試劑瓶下凹瓶位，其中12個試劑瓶下凹瓶位分別用于放置濃縮洗滌液試劑瓶、樣品稀釋液試劑瓶、酶標二抗工作液試劑瓶、底物顯色劑A液試劑瓶、底物顯色劑B液試劑瓶、終止液試劑瓶、200ng/mL的嘔吐毒素標準品溶液試劑瓶、100ng/mL的嘔吐毒素標準品溶液試劑瓶、50ng/mL的嘔吐毒素標準品溶液試劑瓶、25ng/mL的嘔吐毒素標準品溶液試劑瓶、12.5ng/mL的嘔吐毒素標準品溶液試劑瓶和6.25ng/mL的嘔吐毒素標準品溶液試劑瓶，2個備用試劑瓶下凹瓶位分別用于放置高濃度標準品溶液試劑瓶、稀酸溶液試劑瓶、稀堿溶液試劑瓶或吐溫-20溶液試劑瓶。

本實用新型用不同大小、不同顏色的塑料瓶盛裝液體并固定在盒體內側底部的固定座上，與酶標板、微吸管、離心管、比色卡、說明書和蓋板膜一同封裝在試劑盒內，便于攜帶和運輸。每一個試劑盒中的試劑足夠進行96份測定，即可進行一次連續(xù)多個樣品的檢測，也可將酶標板微孔條拆開多次使用。此時，將剩下的微孔條放回鋁箔袋中用自封袋密封，這樣可以保證試劑盒檢測結果的準確性和穩(wěn)定性。

本實用新型的試劑盒根據抗原抗體競爭性免疫層析原理設計，在酶標板微孔條上預包被抗嘔吐毒素單克隆抗體，樣品中污染的嘔吐毒素和酶標二抗直接競爭包被在酶標板微孔條上的單克隆抗體，嘔吐毒素污染物含量越高，酶標二抗和嘔吐毒素單克隆抗體結合數量越少，當加入底物顯色劑溶液時，樣品吸光度值與嘔吐毒素含量呈負相關，與標準曲線比較再乘以其對應的稀釋倍數，即可得出樣品中嘔吐毒素的殘留含量。

本實用新型與現(xiàn)有技術相比具有以下有益效果：

（1）本實用新型的操作步驟包括添加樣品和酶標二抗、添加底物顯色液及硫酸終止液，檢測步驟少、檢測時間短，比傳統(tǒng)間接競爭ELISA試劑盒節(jié)約30min的時間，與傳統(tǒng)理化檢測方法（1d）相比，優(yōu)勢更為明顯；

（2）本實用新型是以抗原抗體分子的特異性、可逆性反應為基礎的分析技術，具有高度的選擇性和敏感性，且具有簡便、快速、篩檢量大等優(yōu)勢，代表著嘔吐毒素殘留檢測的發(fā)展方向；

（3）本實用新型經濟實惠、時效性強，能進行現(xiàn)場檢測，與理化檢測方法相比，檢測成本不到理化分析方法的1/20；

（4）本實用新型主要用于水樣、茶葉、飼料和食品中嘔吐毒素污染殘留檢測，既可用于大批量樣品篩選，又可進行小批量樣品的快速檢測，對于提高食品安全、保障人民身心健康、保持環(huán)境友好與實現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展具有重要現(xiàn)實意義；

（5）本實用新型易于大范圍推廣應用，且適合不同類別的人員使用，如實驗室檢測、海關檢疫、衛(wèi)生監(jiān)督、規(guī)模養(yǎng)殖及個體生產等，具有廣闊的市場前景和顯著的經濟效益和社會效益。

附圖說明

圖1是本實用新型的結構示意圖；

圖2是本實用新型中固定座的結構示意圖。

圖中：1、盒體，2、盒蓋，3、固定座，4、濃縮洗滌液瓶位，5、樣品稀釋液瓶位，6、酶標二抗工作液瓶位，7、底物顯色劑A液瓶位，8、底物顯色劑B液瓶位，9、終止液瓶位，10、標準品溶液瓶位，11、備用試劑瓶下凹瓶位。

具體實施方式

結合附圖詳細描述本實用新型的具體內容。一種嘔吐毒素直接競爭ELISA試劑盒，包括盒體1、連接于盒體1一側的盒蓋2及設置盒體1內側底部的固定座3，所述的盒蓋2覆蓋盒體1的頂部和前側部，邊緣寬度比盒體1突出0.3-0.5cm，用于開關試劑盒。

所述的固定座3上設有12個試劑瓶下凹瓶位和2個備用試劑瓶下凹瓶位11，濃縮洗滌液瓶位4放置有底部形狀為矩形、半透明塑料試劑瓶封裝的100mL濃縮洗滌液（10×），樣品稀釋液瓶位5放置有底部形狀為矩形、藍色帽的半透明塑料試劑瓶封裝的100mL樣品稀釋液，酶標二抗工作液瓶位6放置有紅色塑料試劑瓶封裝的7mL羊抗鼠酶標二抗（GaMIgG-HRP），底物顯色劑A液瓶位7放置有黑色塑料試劑瓶封裝的4mL底物顯色劑A液，底物顯色劑B液瓶位8放置有綠色塑料試劑瓶封裝的4mL底物顯色劑B液，終止液瓶位9放置有黃色塑料試劑瓶封裝的7mL 2M硫酸溶液，標準品溶液瓶位10放置有乳白色塑料試劑瓶封裝的1mL嘔吐毒素標準品溶液共6瓶，濃度分別為200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL和6.25ng/mL，備用試劑瓶下凹瓶位11用于放置的高濃度標準品溶液試劑瓶、稀酸溶液試劑瓶、稀堿溶液試劑瓶、吐溫-20溶液試劑瓶或特殊樣品處理液試劑瓶。

所述試劑盒的盒體1內還放置有酶標板、微吸管、離心管、比色卡、說明書和蓋板膜，所述的酶標板由聚苯乙烯制成，采用96孔試劑板作為固相載體，放于鋁鉑袋內，并且酶標板由外框支撐架和放置其上的可拆裝酶標反應微孔條組成，每個可拆裝酶標反應微孔條有12個反應孔，其上預包被抗嘔吐毒素單克隆抗體。所述的微吸管有四種不同容量，其中1.0mL容量的微吸管30根用于樣品基質的采樣，100μL容量的微吸管10根用于添加終止液，50μL容量的微吸管20根用于添加酶標二抗工作液，30μL容量的微吸管40根用于添加底物顯色劑A液和B液。所述的離心管有三種不同容量，分別為10mL、5mL和1.5mL，主要用于樣品采集和基質前處理。所述的比色卡有5張，顯示不同顏色試劑孔對應的吸光度值，用于水樣、奶制品、茶葉、飼料和食品中嘔吐毒素殘留含量的大概推算。所述的說明書1份，詳細介紹試劑盒的原理、標準曲線、適用范圍、交叉反應率、所需儀器和試劑、使用方法和注意事項。所述的蓋板膜5張，用于樣品檢測時覆蓋酶標板，防止液體蒸發(fā)，影響檢測結果。

樣品基質中嘔吐毒素殘留含量測定：

1）樣品前處理：稱取花生、玉米、小麥、大米及其制品或飼料25g，粉碎后加入10g聚乙二醇8000，用去離子水定容，轉移至均質杯中，均質器高速均質2min，然后4000r/min離心5min或用定量濾紙過濾，取上清液進行樣品檢測。

2）試劑盒的操作步驟：1、將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫（20-25℃）平衡30min，注意每種液體試劑使用前均須搖勻；2、取出所需數量的微孔條，將不用的微孔條放進原錫箔袋中并且與提供的干燥劑一起重新密封，保存于2-8℃；3、編號：將樣品對應微孔按序編號，每個樣品做3孔平行，并記錄樣品孔所在的位置；4、加樣品：將樣品處理液50μL加入酶標板微孔條中，同時加入酶標二抗工作液50μL，混勻靜置15min后洗板，注意檢測設三個重復，并設置NC和BC對照；5、顯色：加底物顯色劑A液和底物顯示劑B液各30μL，靜置5min后洗板；6、終止反應：加入H₂SO₄終止液100μL，靜置5min后酶標儀讀取吸光度值。

3）測定樣品基質中嘔吐毒素殘留含量：

1、定性測定：底物顯色5min后，將樣品孔藍色深淺與比色卡對比，獲得樣品基質中嘔吐毒素殘留含量大概范圍；

2、定量測定：加入終止液靜置5min后，將酶標儀測定的吸光度值代入說明書中的標準曲線，可準確測定樣品基質中嘔吐毒素殘留含量。

4）注意事項：

1、室溫低于20℃或試劑及樣品沒有回到室溫（20-25℃）會導致吸光度值偏低；

2、洗板過程中如出現(xiàn)板孔干燥的情況，會導致標準曲線不成線性，重復性不好的現(xiàn)象；

3、不使用過有效日期的試劑盒，不交換使用不同批號試劑盒中的試劑；

4、標準品、酶標二抗和顯色劑對光敏感，因此恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜封住微孔板；

5、反應終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚；

6、顯色時間按說明書要求進行，否則會導致標準曲線與實際檢測數據不吻合。

以上顯示和描述了本實用新型的基本原理，主要特征和優(yōu)點，在不脫離本實用新型精神和范圍的前提下，本實用新型還有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本實用新型的范圍。