本實用新型屬于免疫膠體金快速檢測領域,具體涉及一種甲硝唑免疫膠體金快速檢測試劑卡。
背景技術:
甲硝唑化學名為2-甲基-5-硝基咪唑-1-乙醇,屬于硝基咪唑類抗菌藥,具有抗厭氧菌和抗原蟲的作用,主要用于治療雞、火雞組織滴蟲病、牛毛滴蟲病,還可與其它抗生素聯(lián)合,用于治療厭氧菌感染。此外,該類藥物還能促進牛、豬等動物的生長,常被用作飼料藥物添加劑。因而極易造成動物源性食品中甲硝唑的殘留。研究表明,甲硝唑對人體有多種毒副作用,包括消化系統(tǒng)、神經系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、皮膚癥狀、泌尿系統(tǒng)等的毒副作用。此外,甲硝唑還具有潛在的致癌作用。
為了食品安全,各國都出臺了相應政策,1998年,歐盟禁止甲硝唑用于動物食品;2002 年,美國FDA禁止在進口動物源性食品中使用甲硝唑及其它硝基咪唑類藥物;2003年,加拿大禁止所有5-硝基咪唑類化合物作為獸藥在食品中使用;2002年,我國農業(yè)部第236號公告規(guī)定,在食源性動物中禁用甲硝唑。盡管如此,動物源性食品中甲硝唑殘留事件時有發(fā)生,因此,檢測動物源性食品、飼料中甲硝唑的含量對保障食品質量安全具有重要意義。
當前,食品中甲硝唑殘留的檢測方法主要有高效液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質譜法、加壓毛細血管法、碳糊電極法、酶聯(lián)免疫分析法等。雖然上述方法靈敏度高、準確性好,能夠定量檢測食品中甲硝唑的殘留量,但是對實驗設備及操作人員的要求高,不適用于現(xiàn)場快速檢測。
技術實現(xiàn)要素:
本實用新型提供一種現(xiàn)場快速檢測甲硝唑的免疫膠體金試劑卡可用于檢測甲硝唑的殘留,檢測樣品可為蜂產品、水產品、雞蛋、奶制品等。本實用新型試劑卡靈敏度高、特異性好、重復性好、檢測時間短,適用于現(xiàn)場快速檢測。
本實用新型試劑卡包括底板和塑料卡套,其特征在于所述底板由PVC板,以及依次黏貼在PVC板上的樣品墊、膠體金結合墊、硝酸纖維素膜、吸水材料墊組成,所述樣品墊、膠體金結合墊、硝酸纖維素膜、吸水材料墊首尾均有1~2mm的重疊,所述硝酸纖維素膜從樣品墊到吸水墊依次噴有相距5~6mm并與膠體金結合墊平行的檢測線和控制線,所述檢測線上包被有甲硝唑-牛血清白蛋白偶聯(lián)物,所述控制線上包被羊抗鼠IgG。
進一步,塑料卡套正面設置有加樣孔與觀察區(qū),所述加樣孔呈漏斗狀,所述塑料卡套內具有固定底板的凹槽,通過卡槽與卡突結合來固定底板。
進一步,加樣孔對應的是底板上的樣品墊,觀察區(qū)對應的是底板上的硝酸纖維素膜,所述加樣孔與觀察區(qū)的長度與寬度分別略小于樣品墊和硝酸纖維素膜。
進一步,樣品墊由玻璃纖維制成,膠體金結合墊由玻璃纖維或聚酯膜制成,吸水材料墊為濾紙。
進一步,膠體金結合墊上包被有抗甲硝唑單克隆抗體-膠體金結合物。
本實用新型試劑卡利用抗體免疫競爭原理,通過抗原與金標抗體的顯色反應特異性檢測樣品中甲硝唑的殘留。當樣品溶液中有甲硝唑殘留時,甲硝唑先與膠體金顆粒上的特異性抗體結合。因此當膠體金顆粒隨樣品擴散至檢測線時,由于膠體金顆粒上特異性抗體的活性位點被樣品中的甲硝唑占據(jù)而無法與檢測線上甲硝唑特異性抗原結合;當樣品中甲硝唑殘留量超出試劑卡的檢出限時,檢測線顯色較控制線淺或者不顯色,判斷結果為陽性。當樣品中甲硝唑殘留量低于試劑卡檢出限時,檢測線顯色較控制線深,判斷結果為陰性。
本實用新型試劑卡各部分作用如下:
樣品墊、膠體金結合墊、硝酸纖維素膜、吸水材料墊首尾均有部分重疊可以做到更快速的層析。
檢測線與控制線與膠體金結合墊平行可以使樣品在層析過程中充分與檢測線、控制線上的抗原/抗體反應,實驗結果顯示更明顯。
加樣孔呈漏斗狀可以防止加樣過程中樣品液濺出而影響實驗結果。
加樣孔的長度和寬度略小于樣品墊可以放置樣品溶液滴出樣品墊外,觀察區(qū)的長度和寬度略小于硝酸纖維素膜可以防止外部雜質進入卡套腔內,并固定硝酸纖維素膜。
本實用新型具有如下有益效果:
(1)高靈敏度。本實用新型對蜂蜜中甲硝唑檢出限為1μg/kg,在同類檢測中達到了較優(yōu)水平。
(2)高特異性。本實用新型以膠體金標記高親和力的單克隆抗體為基礎制備而成,對甲硝唑的交叉反應率為100%,具有高度專一性。
(3)操作簡單快速。本實用新型操作簡單且不依賴大型試驗設備,滴樣后3-5min即可用肉眼判斷硝酸纖維素膜上的檢測線和控制線顏色的深淺來讀取結果。
(4)成本低。本實用新型生產工藝簡單,流程成熟。生產成本低,投資少,收效快。
附圖說明
圖1為甲硝唑免疫膠體金快速檢測試劑卡結構示意圖,其中1為卡槽與卡突結合部,2 為加樣孔,3為樣品墊,4為膠體金結合墊,5為硝酸纖維素膜,6為檢測線,7為控制線,8 為不干膠,9為PVC板,10為吸水材料墊,11為觀察區(qū)。
圖2為甲硝唑免疫膠體金快速檢測試劑卡結果讀取示意圖,其中T為檢測線,C為控制線;圖2-a中T線顏色比C線深或者一樣深,為陰性;圖2-b中T線顏色比C線淺或T線消失,為陽性;圖2-c中C線消失,為無效。
具體實施方式
實施例一甲硝唑免疫膠體金快速檢測試劑卡的制備
本實用新型試劑卡的制備主要包括甲硝唑-載體蛋白偶聯(lián)物的合成、甲硝唑單克隆抗體的制備、膠體金溶液的配置、甲硝唑單克隆抗體-膠體金結合物的制備以及膠體金試紙條的組裝。
1、甲硝唑-載體蛋白偶聯(lián)物的合成
1.1甲硝唑半抗原的合成
將溶解于6mL無水吡啶的585mg琥珀酸酐加入到500mg甲硝唑中(甲硝唑∶琥珀酸酐=1∶2),60℃油浴9h,旋蒸除盡吡啶,得油狀粗產物。加入4℃預冷氯仿和冰水萃取,收集氯仿層。加入無水硫酸鈉脫水,攪拌4h后靜置2h,過濾除去硫酸鈉,收集濾液,除去氯仿后真空干燥3h,得到黃色粉末即為甲硝唑半抗原,4-(2-(2-甲基-5-硝基咪唑)-4-氧代)丁酸MSA。
2.2甲硝唑-牛血清白蛋白(MSA-BSA)及甲硝唑-卵清蛋白(MSA-OVA)的合成
取8mg MSA溶于1mL DMF中,依次加入EDC 12mg,NHS 7mg,室溫避光攪拌16h得到活化酯。取30mg BSA溶于6mL PBS,將活化酯緩慢滴加到BSA中,4℃攪拌反應24h,用0.01mol/L PBS(pH7.4)透析3d,分裝且4℃保存。
將BSA換成OVA,用同樣的方法,合成MSA-OVA。
2、甲硝唑單克隆抗體的制備
選取6~8周齡雌性BALB/c小鼠,取MSA-BSA偶聯(lián)物,20μg/只小鼠,加生理鹽水50μl,與等體積的弗氏完全佐劑乳化,按每只小鼠100μl進行初免,頸部、皮下多點注射。之后每隔兩周加強免疫一次,以不完全佐劑。融合前3d,不加佐劑,腹腔免疫1次。
免疫鼠脾細胞與Sp2/0骨髓瘤細胞按5∶1的比例混合細胞,在50%PEG作用下促進細胞融合,之后置于37℃,體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中,以HAT培養(yǎng)基篩選融合的細胞。用間接抑制ELISA進行陽性篩選。
腹水McAb的制備:BALB/c小鼠腹腔注射滅菌的0.5mL液體石蠟,7~17d后以相同方法注射單抗細胞1×106~2×106個,10d后抽取腹水,離心去除油脂沉淀后即得到小鼠腹水McAb。
3、膠體金溶液的配置
稱取一定量氯金酸,加超純水得到0.01%氯金酸水溶液,取100mL加熱至煮沸,邊攪拌邊加入1.5mL 1%檸檬酸三鈉溶液。繼續(xù)加熱煮沸至溶液呈酒紅色,冷卻至室溫,加超純水恢復至原體積,4℃儲存。
4、甲硝唑單克隆抗體-膠體金結合物的制備
取已制備好的膠體金溶液50mL,調至標記pH值,邊攪拌邊加入最適濃度的單克隆抗體,繼續(xù)攪拌20min,后加入5%的BSA至最終質量分數(shù)為1%。在4℃下,1500r/min離心10min 后棄上清,所得沉淀用0.01mol/LPB溶液(1%BSA和0.05%NaN3)重懸,置于4℃保存。
5、膠體金試紙條的組裝
將稀釋好的MSA-BSA和羊抗鼠IgG通過點膜機噴于NC膜上,形成間隔5mm的檢測線 (T線)和控制線(C線),37℃烘箱干燥7h;甲硝唑單克隆抗體-膠體金結合物按3μL/cm噴至玻璃纖維上制成膠體金結合墊,37℃烘箱干燥8h;依次將樣品墊、膠體金結合墊、NC膜、吸水墊黏于PVC板上,用切條機切成4.00mm寬度的試紙條,裝入下塑料模板的凹槽中,卡槽與卡突結合固定成試劑卡,再放入帶有干燥劑的鋁箔袋中密封保存。
實施例二甲硝唑免疫膠體金快速檢測試劑卡的使用方法
1、樣品制備
取蜂蜜樣品4g,加入1mL MNZA液,振蕩混勻,加入8mL乙酸乙酯上下反轉振蕩3min,靜置后取上清4mL吹干,加300μL復溶液復溶,取100μL待檢。
2、操作方法
將試劑卡和待檢樣品溶液恢復至室溫。將試劑卡從鋁箔袋中取出,水平放置于觀察者正面,用滴管吸取待檢樣品溶液于加樣孔中垂直滴加3滴(約100μL),加樣后開始計時,在 3~5min內判讀結果,其它時間判讀無效。
3、結果判讀
本實驗采用對比法判讀實驗結果。若T線(檢測線,靠近加樣孔一端)顯色比C線(控制線)顯色深或一樣深,判定為陰性;若T線顯色比C線顯色淺,或T線無顯色,判定結果為陽性;若C線未出現(xiàn)則判定為無效。
實施例三甲硝唑免疫膠體金快速檢測試劑卡的檢出限測定
1、操作步驟
取蜂蜜樣品4g,加入甲硝唑標準溶液至終濃度為0.25、0.5、1.0、2.0、4.0μg/kg,再按照實施例二的使用方法進行樣品處理,用實例一制備的試劑卡分別對其進行檢測。陰性對照為0.01mol/LPBS溶液。每組設6個平行樣。
2、實驗結果
實驗結果如表1所示,檢測線顏色呈梯度遞增。在陰性對照及甲硝唑終濃度為0.25、0.5 μg/kg范圍內,C線顯色而T線不顯色;1.0~4.0μg/kg范圍內C線與T線顯色。實驗過程中,各組平行樣均顯色穩(wěn)定。實驗結果表明,本試劑卡的甲硝唑檢測限為1.0μg/kg。
表1甲硝唑免疫膠體金快速檢測試劑卡檢出限
a濃度單位:μg/kg;b顯色程度:-代表不顯色,+代表顯色;c穩(wěn)定性:-代表不穩(wěn)定,+代表穩(wěn)定。