本發(fā)明屬于生物，尤其涉及一種非洲豬瘟病毒全蛋白質(zhì)芯片及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、非洲豬瘟(asf)是由非洲豬瘟病毒(asfv)感染引起的豬傳染性疾病。非洲豬瘟有多種臨床表現(xiàn)形式，從特急性、急性、亞急性到慢性和無癥狀，取決于感染病毒株類型，豬的類型以及感染方式。急性發(fā)病形式由高毒力毒株引起，表現(xiàn)為高熱，食欲不振，皮膚紅斑以及其他血管炎相關(guān)的特征性病理改變，致死率可高達(dá)100％。目前缺乏安全有效的疫苗和藥物。asfv粒子直徑250nm左右，具囊膜，呈正二十面體，具有五層結(jié)構(gòu)，脫去囊膜后仍具有感染性。病毒基因組170-190kb，編碼160余種蛋白，有60多種結(jié)構(gòu)蛋白，大部分蛋白的結(jié)構(gòu)和功能未知，與宿主間相互作用關(guān)系不明，激活免疫反應(yīng)的免疫原與免疫保護(hù)之間的相關(guān)性也不明確。

2、造成非洲豬瘟防控方面被動的最根本原因之一在于非洲豬瘟病毒基礎(chǔ)研究方面的薄弱，疫苗和藥物相關(guān)的研發(fā)無從下手。非洲豬瘟病毒的b細(xì)胞抗原，研究最多的是b646l、cp204l、e183l和ep402r，而這四種抗原無論怎么組合用不同形式免疫都無法產(chǎn)生有效的抗病毒保護(hù)作用。非洲豬瘟病毒的160余種蛋白，能產(chǎn)生抗體的蛋白不止以上提及4種，它們具體是哪些？在疾病發(fā)生發(fā)展中有何規(guī)律？在抵抗病毒感染時，哪些種類的抗體能發(fā)揮有效作用？針對非洲豬瘟病毒這種多蛋白、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的病毒，傳統(tǒng)的單一因素或單一水平的病毒研究無法滿足需求，需要采用多因素、多水平的分析思路和高通量的全局性篩選方法來理解和解決問題。

3、蛋白質(zhì)芯片，也稱蛋白微陣列，是微型化、快速并行、高通量的蛋白質(zhì)分析系統(tǒng)，通常是成千上萬不同的蛋白質(zhì)或多肽高密度固定在固相載體上。在過去近二十年中，該技術(shù)廣泛應(yīng)用于臨床和基礎(chǔ)研究。蛋白質(zhì)組芯片屬于功能型正相蛋白芯片，是將某一物種的全部蛋白質(zhì)點制在芯片上，將分析樣品與芯片進(jìn)行孵育，漂洗并將未能與芯片蛋白結(jié)合的成分洗去，然后用熒光標(biāo)記的抗體進(jìn)行孵育，最后利用熒光掃描儀讀取芯片各點的熒光信號值。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為了彌補傳統(tǒng)研究方法的不足，本發(fā)明提供一種非洲豬瘟全蛋白質(zhì)芯片及制備方法。該芯片包含160種非洲豬瘟病毒蛋白，芯片質(zhì)檢表明，該芯片制備成功。應(yīng)用芯片篩選感染豬或免疫豬的血清，發(fā)現(xiàn)新b細(xì)胞抗原及潛在保護(hù)性b細(xì)胞抗原。應(yīng)用芯片篩選病毒蛋白與豬宿主免疫相關(guān)蛋白的互作，發(fā)現(xiàn)潛在病毒免疫調(diào)節(jié)因子。本發(fā)明本質(zhì)上是對蛋白質(zhì)進(jìn)行大規(guī)模、全局性的分析研究。

2、本發(fā)明的目的是提供一種蛋白芯片。

3、第一方面，本發(fā)明提供的蛋白芯片，包括基片和與其固定的160種非洲豬瘟病毒蛋白；且每種蛋白單獨成立一個檢測點；

4、所述160種非洲豬瘟病毒蛋白為dp63r，l60l，o61r，c62l，dp60r，a118r，e66l，b66l，i177l，x69r，dp71l，k78r，i73r，ep84r，cp80r，dp79l，l83l，c84l，dp96r，c122r，i9r，a104r，l11l，mgf_110-2l，i7l，h108r，i8l，d117l，e111r，b117l，mgf_110-14l，cp123l，e120r，mgf_110-12l，mgf_110-4l，mgf_110-3l，mgf_110-1l，d129l，b119l，b125r，h124r，mgf_110-8l，mgf_100-1r，c129r，a137r，mgf_110-7l，e146l，k145r，ep152r，c147l，ep153r，e165r，a151r，f165r，b169l，i10l，h171r，e183l，o174l，b175l，a179l，p14，kp177r，e184l，s183l，e199l，k196r，i196l，k205r，cp204l，d205r，mgf_110-5l-6l，i215l，h233r，a238l，a224l，i226r，a240l，mgf_360-18r，c257l，dp238l，h240r，e248r，d250r，i243l，b263r，s273r，mgf_300-1l，qp383r，mgf_110-13l，i267l，mgf_505-3r，ep296r，mgf_360-15r，cp312r，e301r，r298l，mgf_360-16r，f317l，b318l，mgf_360-8l，c315r，d339l，mgf_300-4l，d345l，f334l，p34，h339r，mgf_360-10l，mgf_360-12l，ep402r，mgf_360-13l，h359l，mgf_360-9l，ep364r，mgf_360-14l，mgf_360-21r，mgf_360-11l，mgf_360-3l，mgf_360-1l，mgf_360-2l，mgf_360-6l，p37，mgf_360-4l，b354l，np419l，b385r，b407l，e423r，ep424r，b438l，k421r，m448r，b475l，qp509l，mgf_505-9r，b602l，mgf_505-5r，c475l，cp530r，mgf_505-6r，mgf_505-7r，mgf_505-2r，mgf_505-10r，b646l，q706l，c717r，f778r，np868r，a859l，b962l，c962r，f1055l，d1133l，p1192r，g1211r，ep1242l，m1249l，g1340l和p150。

5、優(yōu)選地，所述非洲豬瘟病毒蛋白的種類數(shù)為160種，蛋白覆蓋率占整個非洲豬瘟病毒蛋白質(zhì)組的95％。

6、上述非洲豬瘟病毒為非洲豬瘟病毒(african?swine?fever?virus)sy18，上述蛋白來自于該病毒。

7、上述蛋白芯片中，所述基片為path蛋白芯片基片。

8、上述蛋白芯片中，所述蛋白芯片是將所述160種蛋白點樣于path蛋白芯片基片上制成的。

9、上述全蛋白芯片包括若干矩陣，每個矩陣中包括所述160個非洲豬瘟病毒蛋白、陽性對照、陰性對照和空白對照。

10、優(yōu)選地，所述矩陣中，每種非洲豬瘟病毒蛋白、對照設(shè)置3個重復(fù)點。

11、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述矩陣的數(shù)量為每張芯片14個，所述對照包括陽性對照、陰性對照、空白對照?？尚纬?4個檢測窗，可同時檢測14個樣品。

12、優(yōu)選地，所述芯片上的點樣點是采取生物芯片點樣儀點樣于芯片基片上的。在本發(fā)明的實施例中，所述陽性對照為豬源的igg、igm和iga；

13、所述陰性對照為gst標(biāo)簽；

14、所述空白對照為芯片樣本稀釋液。

15、優(yōu)選地，所述非洲豬瘟病毒蛋白的制備具體為：將連接有所述蛋白基因序列的克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)入釀酒酵母過表達(dá)、通過融合標(biāo)簽親和純化即可得到純化的重組蛋白質(zhì)，該純化的重組蛋白質(zhì)濃度大于或等于5μg/ml。

16、上述蛋白芯片按照如下方法制備：蛋白質(zhì)點制于path基片(購自美國grace?bio-labs公司)表面，每張芯片有14個矩陣，每個矩陣包括160種非洲豬瘟病毒蛋白、陰性對照、陽性對照和空白對照，非洲豬瘟蛋白和各對照蛋白在每個陣距中有3個重復(fù)的點。4℃，過夜固定(蛋白通過與基片通過吸附相互作用)，即完成蛋白芯片的構(gòu)建。

17、第二方面，本發(fā)明提供了含有第一方面所述蛋白芯片的試劑盒。

18、上述試劑盒還包括標(biāo)記熒光的宿主血清的抗體(如cy5熒光抗豬二抗)、芯片樣本稀釋液、芯片洗滌液等。

19、第三方面，本發(fā)明提供了第一方面所述蛋白芯片或第二方面所述試劑盒在如下至少一種中的應(yīng)用：

20、1)篩選或輔助篩選非洲豬瘟病毒蛋白抗原；

21、2)篩選或輔助篩選非洲豬瘟病毒保護(hù)性抗原或抗原組合；

22、3)構(gòu)建非洲豬瘟病毒蛋白抗原庫；

23、4)篩選或輔助篩選與非洲豬瘟病毒或疫苗作用宿主后產(chǎn)生抗體特異結(jié)合的蛋白或蛋白組合；

24、5)構(gòu)建與非洲豬瘟病毒或疫苗作用宿主后產(chǎn)生抗體特異結(jié)合的蛋白數(shù)據(jù)庫；

25、6)篩選或輔助篩選非洲豬瘟病毒的免疫調(diào)節(jié)因子；

26、7)篩選或輔助篩選與感染宿主免疫相關(guān)蛋白相互作用的非洲豬瘟蛋白；

27、8)構(gòu)建非洲豬瘟病毒的免疫調(diào)節(jié)因子數(shù)據(jù)庫；

28、9)檢測或結(jié)合非洲豬瘟病毒抗體。

29、上文所述抗原為b細(xì)胞抗原。

30、上文非洲豬瘟病毒抗體為非洲豬瘟病毒或疫苗作用宿主后產(chǎn)生抗體，具體為非洲豬瘟病毒感染宿主后產(chǎn)生抗體或非洲豬瘟病毒疫苗注射宿主后產(chǎn)生抗體。

31、上述非洲豬瘟病毒蛋白抗原庫可以為數(shù)據(jù)庫，也可也為將蛋白抗原原核表達(dá)純化出來獲得的實體庫。

32、第四方面，本發(fā)明提供了第一方面所述蛋白芯片中的160種非洲豬瘟病毒蛋白在制備具有如下至少一種功能的產(chǎn)品中的應(yīng)用：

33、1)篩選或輔助篩選非洲豬瘟病毒蛋白抗原；

34、2)篩選或輔助篩選非洲豬瘟病毒保護(hù)性抗原或抗原組合；

35、3)構(gòu)建非洲豬瘟病毒蛋白抗原庫；

36、4)篩選或輔助篩選與非洲豬瘟病毒或疫苗作用宿主后產(chǎn)生抗體特異結(jié)合的蛋白或蛋白組合；

37、5)構(gòu)建與非洲豬瘟病毒或疫苗作用宿主后產(chǎn)生抗體特異結(jié)合的蛋白數(shù)據(jù)庫；

38、6)篩選或輔助篩選非洲豬瘟病毒的免疫調(diào)節(jié)因子；

39、7)篩選或輔助篩選與感染宿主免疫相關(guān)蛋白相互作用的非洲豬瘟蛋白；

40、8)構(gòu)建非洲豬瘟病毒的免疫調(diào)節(jié)因子數(shù)據(jù)庫；

41、9)檢測或結(jié)合非洲豬瘟病毒抗體。

42、上文所述抗原為b細(xì)胞抗原。

43、上文非洲豬瘟病毒抗體為非洲豬瘟病毒或疫苗作用宿主后產(chǎn)生抗體。

44、上述產(chǎn)品可以為蛋白芯片。

45、上述非洲豬瘟病毒蛋白抗原庫可以為數(shù)據(jù)庫，也可以為將蛋白抗原原核表達(dá)純化出來獲得的實體庫。

46、第五方面，本發(fā)明提供了一種篩選或輔助篩選非洲豬瘟病毒蛋白抗原或抗原組合的方法，包括如下步驟：

47、1)將第一方面所述蛋白芯片和感染非洲豬瘟病毒的宿主血清或免疫非洲豬瘟病毒疫苗的宿主血清反應(yīng)，得到反應(yīng)產(chǎn)物；

48、2)再向步驟1)的反應(yīng)產(chǎn)物中添加標(biāo)記熒光的所述宿主血清的抗體，進(jìn)行反應(yīng)，得到熒光反應(yīng)產(chǎn)物；

49、3)檢測熒光反應(yīng)產(chǎn)物的熒光信號，確定第一方面所述蛋白芯片中某個蛋白是否為或候選為非洲豬瘟病毒蛋白抗原或抗原組合。

50、上文所述確定方法如下：若第一方面所述蛋白芯片中某個蛋白的熒光反應(yīng)產(chǎn)物的熒光信號值大于閾值，則該蛋白為或候選為非洲豬瘟病毒抗體陽性蛋白。

51、以健康宿主血清為對照；

52、所述閾值為即健康宿主血清樣本中各個蛋白抗體反應(yīng)信號平均值+3倍標(biāo)準(zhǔn)差。

53、上文所述方法還包括步驟4)：將步驟3)確定的所述非洲豬瘟病毒蛋白抗原分別作為檢測抗原，酶聯(lián)免疫檢測其與非洲豬瘟病毒抗體是否發(fā)生抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，若發(fā)生反應(yīng)，則該蛋白為非洲豬瘟病毒蛋白抗原；若沒有發(fā)生反應(yīng)，則該蛋白不為非洲豬瘟病毒蛋白抗原。

54、上述步驟4)中，確定的所述非洲豬瘟病毒蛋白抗原在作為檢測抗原時，需要經(jīng)過原核表達(dá)純化后進(jìn)行酶聯(lián)免疫檢測。上述原核表達(dá)純化后的目的是提高表達(dá)量，能夠?qū)崿F(xiàn)elisa檢測。

55、上述非洲豬瘟病毒抗體為感染非洲豬瘟病毒的宿主血清或免疫非洲豬瘟病毒疫苗的宿主血清。

56、第六方面，本發(fā)明提供了一種高通量檢測非洲豬瘟病毒全蛋白質(zhì)組特異性抗體的方法，包括如下步驟：

57、1)將第一方面所述蛋白芯片上的所有非洲豬瘟病毒蛋白與感染非洲豬瘟病毒的宿主血清或免疫非洲豬瘟病毒疫苗的宿主血清反應(yīng)，在芯片上得到反應(yīng)產(chǎn)物；

58、2)再向步驟1)的所述反應(yīng)產(chǎn)物中添加標(biāo)記熒光的所述宿主血清的抗體，進(jìn)行反應(yīng)，得到熒光標(biāo)記的反應(yīng)產(chǎn)物；

59、3)檢測所述熒光標(biāo)記的反應(yīng)產(chǎn)物的熒光信號，確定宿主血清中是否含有針對所述蛋白芯片上某個非洲豬瘟蛋白的特異性結(jié)合抗體。

60、上文所述確定方法如下：若所述蛋白芯片中某個非洲豬瘟蛋白對應(yīng)的熒光標(biāo)記的反應(yīng)產(chǎn)物的熒光信號值大于閾值，則所述宿主血清中含有或候選含有針對該非洲豬瘟蛋白的特異性結(jié)合抗體。

61、以健康宿主血清為對照；

62、所述閾值為即健康宿主血清樣本中各個蛋白抗體反應(yīng)信號平均值+3倍標(biāo)準(zhǔn)差。

63、第七方面，本發(fā)明提供了一種篩選或輔助篩選非洲豬瘟病毒的免疫調(diào)節(jié)因子的方法，包括如下步驟：

64、1)將第一方面所述蛋白芯片和生物素標(biāo)記的宿主免疫相關(guān)蛋白反應(yīng)，得到蛋白與蛋白結(jié)合產(chǎn)物；

65、2)再向所述蛋白與蛋白結(jié)合產(chǎn)物中添加標(biāo)記熒光的親和素，進(jìn)行反應(yīng)，得到標(biāo)記熒光的蛋白與蛋白結(jié)合產(chǎn)物；

66、3)檢測所述標(biāo)記熒光的蛋白與蛋白結(jié)合產(chǎn)物的熒光信號，確定第一方面所述蛋白芯片中某個蛋白是否為潛在的免疫調(diào)節(jié)因子。

67、上文所述確定方法如下：若第一方面所述蛋白芯片中某個蛋白的芯片結(jié)果信噪比大于3，則該非洲豬瘟蛋白為或候選為免疫調(diào)節(jié)因子；

68、芯片結(jié)果信噪比為snr(+)/snr(-)，芯片與純生物素組(生物素標(biāo)記試劑)反應(yīng)的結(jié)果定義為snr(-)，芯片與生物素化蛋白組(生物素化宿主免疫相關(guān)蛋白)反應(yīng)的結(jié)果定義為snr(+)；以生物素標(biāo)記試劑作為對照，記作純生物素組。

69、所述宿主免疫相關(guān)蛋白為perk、irf3、p65、lc8、il-1β和/或iκbα。

70、第八方面，本發(fā)明提供了如下應(yīng)用：

71、本發(fā)明提供了第一方面所述蛋白芯片中的r298l、p1192r和s273r蛋白在制備結(jié)合或檢測免疫相關(guān)蛋白irf3的產(chǎn)品中的應(yīng)用；

72、或本發(fā)明提供了第一方面所述蛋白芯片中的r298l、p1192r和s273r蛋白在作為免疫相關(guān)蛋白irf3的互作蛋白中的應(yīng)用；

73、或，本發(fā)明提供了第一方面所述蛋白芯片中的l60l、mgf360-12l和i73r蛋白在制備結(jié)合或檢測免疫相關(guān)蛋白perk的產(chǎn)品中的應(yīng)用；

74、或本發(fā)明提供了第一方面所述蛋白芯片中的l60l、mgf360-12l和i73r蛋白在作為免疫相關(guān)蛋白perk的互作蛋白中的應(yīng)用；

75、或本發(fā)明提供了第一方面所述蛋白芯片中的r298l、p1192r、s273r、l60l、mgf360-12l和i73r蛋白在作為免疫調(diào)節(jié)因子中的應(yīng)用。

76、本發(fā)明具有以下優(yōu)點：本發(fā)明提供的非洲豬瘟全蛋白質(zhì)芯片，是一種高通量分析檢測平臺，憑借其獨特的優(yōu)勢，如微型化、通量高、快速檢測、樣品需求量少靈敏度高等，可實現(xiàn)快速、高效、系統(tǒng)地了解非洲豬瘟病毒的生物學(xué)特性，尤其是非洲豬瘟病毒蛋白的b細(xì)胞免疫原性，從而為其診斷、防控、疫苗研發(fā)等奠定基礎(chǔ)。