本發(fā)明屬于化學(xué)生物學(xué)研究方向底物鑒定研究領(lǐng)域，具體涉及通過對比野生型和突變型修飾酶探針富集底物的差異來特異性鑒定修飾底物的方法。

背景技術(shù)：

1、修飾酶介導(dǎo)的底物修飾在多種生物學(xué)過程中起重要的調(diào)控作用，因此有效地鑒定修飾酶的底物對于揭示修飾酶的調(diào)控機制具有重要意義。供體的類似物可以標(biāo)記修飾酶的底物(文獻1.wang,r.；zheng,w.h.；yu,h.q.；deng,h.t.；luo,m.k.,labeling?substratesof?protein?arginine?methyltransferase?with?engineered?enzymes?and?matched?s-adenosyl-l-methionine?analogues.journal?of?the?american?chemical?society,2011,133:7648-7651.)，但是大多數(shù)的修飾酶不能有效地利用類似物進行修飾，限制了其使用。親和質(zhì)譜技術(shù)(affinity?purification?coupled?with?mass?spectrometry,ap-ms)是鑒定相互作用的有效方法，也用來鑒定修飾酶的底物(文獻2.dansu,d.k.；liang,j.l.；selcen,i.；zheng,h.y.；moore,d.f.；casaccia,p.,prmt5?interacting?partners?andsubstrates?in?oligodendrocyte?lineage?cells.frontiers?in?cellularneuroscience,2022,16:820226.)，然而作用力強的相互作用會抑制瞬時和作用力弱的相互作用，不能有效地鑒定作用力弱的底物。鄰近標(biāo)記技術(shù)biotin?identification(bioid)也用來鑒定底物(文獻3.wei,h.h.；fan,x.j.；hu,y.；tian,x.x.；guo,m.；mao,m.w.；fang,z.y.；wu,p.；gao,s.x.；peng,c.；yang,y.；wang,z.f.,a?systematic?survey?of?prmtinteractomes?reveals?the?key?roles?of?arginine?methylation?in?the?globalcontrol?of?rna?splicing?and?translation.science?bulletin,2021,66:1342-1357.)，然而，該策略不能區(qū)分底物與非底物。目前方法在鑒定修飾酶底物方面效率較低，因此，迫切需要有效的方法來鑒定修飾底物。

2、為了有效地區(qū)分底物和非底物，本發(fā)明通過對比野生型和突變型修飾酶光反應(yīng)活性探針富集的底物來特異性地鑒定修飾底物。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種可以簡便、低成本、重復(fù)性好的特異性鑒定修飾酶底物的方法。

2、本發(fā)明提供的方法是利用野生型修飾酶探針和突變型修飾酶探針對底物識別能力的不同而建立的方法。監(jiān)測野生型修飾酶探針和突變型修飾酶探針富集的底物豐度，通過對比兩種探針富集底物豐度的差異，可以特異性地鑒定修飾底物。

3、基于光反應(yīng)活性探針的修飾酶底物的鑒定方法具體步驟如下：

4、(1)將野生型修飾酶和突變型修飾酶分別與探針反應(yīng)得到光反應(yīng)活性的野生型修飾酶探針和突變型修飾酶探針；

5、(2)將野生型修飾酶探針和突變型修飾酶探針分別與生物樣品孵育、光交聯(lián)和富集交聯(lián)的底物；

6、(3)分別檢測野生型修飾酶探針和突變型修飾酶探針中富集底物的豐度；

7、(4)野生型修飾酶探針/突變型修飾酶探針富集底物豐度的比值大于1(優(yōu)選大于1.2，最優(yōu)選大于1.5)，即為野生型修飾酶的底物。

8、修飾酶可以為蛋白修飾酶、dna修飾酶、rna修飾酶等其中的一種或二種以上，但不限于這些修飾酶；將野生型修飾酶與底物結(jié)合的活性中心(野生型修飾酶中能夠直接與底物相結(jié)合，并催化底物化學(xué)反應(yīng)的部位；活性中心分為結(jié)合部位，結(jié)合底物的部分，催化部位，催化底物化學(xué)反應(yīng)的部位；突變結(jié)合部位的氨基酸殘基，野生型修飾酶失去結(jié)合底物的能力)上的1-3個氨基酸殘基突變(將野生型修飾酶結(jié)合部位的1-3個氨基酸變成其它與其不同的氨基酸)，優(yōu)先選擇不破壞修飾酶的空間構(gòu)象的突變。

9、探針包含反應(yīng)基團、連接子、光反應(yīng)基團和富集基團；反應(yīng)基團、光反應(yīng)基團和富集基團之間以連接子相連；連接子為聚乙二醇(聚合度200-8000)、烷烴(鏈長3-20個碳原子)等其中的一種或二種以上，但不限于這些基團；反應(yīng)基團可以與修飾酶上的氨基、羧基等其中的一種或二種以上基團發(fā)生反應(yīng)，其可為n-羥基琥珀酰亞胺、羥基、胍基等其中的一種或二種以上，但不限于這些基團；光交聯(lián)基團為苯甲酮、疊氮苯、雙吖丙啶等其中的一種或二種以上，但不限于這些基團；富集基團為炔基、疊氮、生物素等其中的一種或二種以上，但不限于這些基團。

10、將野生型修飾酶和突變型修飾酶分別表達純化，在緩沖液中分別與探針發(fā)生反應(yīng)，得到野生型修飾酶探針和突變型修飾酶探針；緩沖液包括pbs、羥乙基哌嗪乙硫磺酸、三(羥甲基)氨基甲烷等其中的一種或二種以上，但不限于這些緩沖液；修飾酶與探針的摩爾比為1:1-1:100(優(yōu)選1:10)，優(yōu)選的摩爾比是保持修飾酶的空間構(gòu)象；探針與修飾酶反應(yīng)的時間為1-120s(優(yōu)選60s)，優(yōu)選的反應(yīng)時間是一個修飾酶蛋白分子只反應(yīng)上一個探針。

11、生物樣品包括一種或二種以上蛋白質(zhì)、dna、rna等中的一種或二種以上混合物；蛋白質(zhì)、dna、rna等中的一種或二種以上混合物包括組織和/或細胞提取液中的一種或二種以上；組織或細胞為來源于細菌、動物、植物或人中的一種或二種以上的組織或細胞；組織和/或細胞提取液的獲取是利用緩沖液裂解組織和/或細胞，此時應(yīng)保持生物樣品中蛋白質(zhì)、dna或rna等的天然空間構(gòu)象；優(yōu)選的緩沖液，含有100-500mm氯化鈉和體積濃度0.5-2％乙基苯基聚乙二醇的5-100mm三(羥甲基)氨基甲烷水溶液，組織和/或細胞于緩沖液進行超聲破碎裂解。

12、孵育過程：將野生型修飾酶探針和突變型修飾酶探針分別與保持天然構(gòu)象的生物樣品孵育，修飾酶與底物最大結(jié)合量的最優(yōu)時間為1-4h，獲得修飾酶與底物的混合物；光交聯(lián)過程：保持修飾酶在紫外照射下的天然構(gòu)象，修飾酶與底物的混合物紫外照射10-60min，獲得紫外交聯(lián)后修飾酶與底物的混合物；富集過程：利用富集材料分別將野生型修飾酶探針和突變型修飾酶探針富集的底物pull-down下來，富集材料與紫外交聯(lián)后修飾酶與底物的混合物孵育時間為1-5h(優(yōu)選2h)，獲得野生型修飾酶探針和突變型修飾酶探針富集的底物和富集材料的非特異性吸附；富集的材料包括酰肼樹脂、avidin瓊脂糖小球等其中的一種或二種以上，但不局限于這些富集材料；洗滌富集材料的非特異性吸附依據(jù)結(jié)合力的強弱進行適當(dāng)調(diào)整；優(yōu)選，洗滌緩沖液ⅰ為5-100mm三(羥甲基)氨基甲烷、ph值為7-10，體積濃度0.1-10％十二烷基硫酸鈉；洗滌緩沖液ⅱ為5-100mm三(羥甲基)氨基甲烷、ph值為7-10，0.1-10m尿素；洗滌緩沖液ⅲ為5-100mm三(羥甲基)氨基甲烷、ph值為7-10，0.1-10m氯化鈉；洗滌富集材料的非特異性吸附后，將底物保留在富集材料上，獲得野生型修飾酶探針和突變型修飾酶探針富集的底物；利用蛋白酶將野生型修飾酶探針和突變型修飾酶探針富集的底物分別進行酶解，獲得酶解液，利用c18固相萃取柱分別去除酶解液中的雜質(zhì)，利于后續(xù)的質(zhì)譜分析，獲得野生型修飾酶探針和突變型修飾酶探針富集底物的豐度，但不局限于以上方法。

13、底物豐度的檢測包括野生型修飾酶探針富集的底物和突變型修飾酶探針富集的底物；底物的豐度(intensity)包括分子的相對含量、氣相色譜的峰面積、液相色譜的峰面積等其中的一種或二種以上，但不局限于這些；檢測修飾酶探針富集底物的豐度方法包括sourthernblot、northernblot、western?blot、定量蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)中的一種或二種以上，但不局限于以上方法；定量蛋白質(zhì)組學(xué)中蛋白或肽段的定量方法包括無標(biāo)定量或標(biāo)記定量中的一種或二種；其中標(biāo)記定量方法包括silac、二甲基標(biāo)記、itraq或tmt等同位素標(biāo)記方法中的一種或二種以上。

14、修飾酶底物的篩選標(biāo)準(zhǔn)為野生型修飾酶探針/突變型修飾酶探針富集底物的豐度比值大于1(優(yōu)選大于1.2，最優(yōu)選大于1.5)，即為篩選出的野生型修飾酶的底物；該閾值根據(jù)檢測底物豐度方法的不同可做適當(dāng)調(diào)整(通過最大靈敏度和特異性的值來確定最佳閾值)。

15、本發(fā)明的優(yōu)點：

16、本發(fā)明是基于光反應(yīng)活性探針的策略來特異性地鑒定修飾酶的瞬時底物，使得底物和修飾酶共價連接，利于去除非特異性吸附；通過對比野生型修飾酶探針和突變型修飾酶探針富集的底物，可以特異性地鑒定修飾底物；本發(fā)明應(yīng)用廣泛，該方法可擴展至各種類型的修飾酶，通過簡單地改變探針骨架可有效地鑒定其它酶和底物的相互作用。