本申請涉及檢測，尤其涉及檢測肌酸激酶同工酶的試劑盒及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、肌酸激酶(creatinekinase，ck)廣泛存在于各種組織中，并且與三磷酸腺苷(atp)的再生有關(guān)，在生理水平上維持細(xì)胞內(nèi)的三磷酸腺苷濃度。

2、ck是一個(gè)異二聚體，亞單位有m型和b型，主要分為ck-bb，ck-mm，ck-mb三種同工酶，線粒體內(nèi)還含有另外的ck-mt同工酶。ck-bb主要存在于腦、前列腺等器官，ck-mm主要存在于骨骼和心肌，ck-mb則主要存在于心肌。正常人血清中ck-mb含量低于總活性5％，當(dāng)急性心肌梗死后胸痛發(fā)作，血清中ck-mb于4小時(shí)升高，24小時(shí)達(dá)高峰值，至3-4天恢復(fù)。ck-mb是心肌損傷的重要標(biāo)志物之一。

3、目前檢測ck-mb的方法有瓊脂糖凝膠電泳法、酶速率免疫抑制法、化學(xué)發(fā)光免疫測定法和膠乳免疫比濁法。

4、酶速率免疫抑制法易受多因素影響，假陽性高。它使用一種針對ck-m的單克隆抗體，抑制標(biāo)本中ck-m亞單位的活性，不影響ck-b亞單位的活性，通過酶促反應(yīng)測出剩余ck-mb和ck-bb中b亞基活性。當(dāng)腦、前列腺、胃腸、肺等組織細(xì)胞損傷、缺血、壞死時(shí)，ck-bb就會(huì)被釋放入血清，容易造成了ck-mb假性增高；同時(shí)腫瘤、免疫功能紊亂人群釋放的巨ck(一種低聚的線粒體ck)存在時(shí)也會(huì)參與酶促反應(yīng)，巨ck不會(huì)被抗ck-m亞基抗體抑制，活性被100％檢出，會(huì)成倍擴(kuò)大了ck-mb檢測結(jié)果，使ck-mb假性增高。

5、瓊脂糖凝膠電泳法是分離、檢測心肌肌酸激酶同工酶的常用方法，采用瓊脂糖凝膠為介質(zhì)，分離蛋白，計(jì)算ckmm、ckmb、ckbb百分含量。該方法需人工操作，檢測時(shí)間長，無法實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。

6、化學(xué)發(fā)光免疫測定法基于雙抗體夾心法原理，將特異性鼠單克隆抗體預(yù)先包被在載體上，加入待測樣本和酶標(biāo)記的特異性單克隆抗體，形成特異性抗體-抗原-酶標(biāo)記抗體的免疫復(fù)合物，經(jīng)過激發(fā)后發(fā)出光子，根據(jù)激發(fā)光的大小得出樣本中ck-mb的質(zhì)量數(shù)。該方法特異性強(qiáng)，但價(jià)格昂貴。

7、膠乳免疫比濁法一種較為穩(wěn)定、準(zhǔn)確的體液蛋白均相免疫比濁檢測方法。當(dāng)ckmb與偶聯(lián)抗體ckmb的微球結(jié)合后，迅速聚集，改變反應(yīng)溶液的吸光度，一定范圍內(nèi)成線性關(guān)系，換算可得ckmb的濃度。

8、樣本中肌酸激酶同工酶與試劑中的抗肌酸激酶同工酶抗體致敏膠乳結(jié)合，形成不溶性免疫復(fù)合物，在特定的緩沖環(huán)境中形成濁度，其濁度在檢測范圍內(nèi)與待測物含量成比例關(guān)系，與相同條件下操作的校準(zhǔn)品比較，即可求出樣本中肌酸激酶同工酶的含量。

9、目前的肌酸激酶同工酶檢測試劑盒存在以下問題：(1)試劑穩(wěn)定性差，易沉淀；(2)試劑線性范圍窄、靈敏度差，一般為3-180ng/ml；(3)試劑易受甘油三脂干擾；(4)試劑易受類風(fēng)濕因子干擾。

10、綜上所述，目前的肌酸激酶同工酶檢測試劑盒對肌酸激酶同工酶的檢測靈敏度較差。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本申請實(shí)施例的目的在于提出一種檢測肌酸激酶同工酶的試劑盒及應(yīng)用，有效提高對肌酸激酶同工酶的檢測靈敏度。

2、為了解決上述技術(shù)問題，本申請實(shí)施例提供一種檢測肌酸激酶同工酶的試劑盒，采用了如下所述的技術(shù)方案：

3、一種檢測肌酸激酶同工酶的試劑盒，包括：

4、第一檢測試劑和第二檢測試劑；

5、所述第一檢測試劑包括hepes緩沖液、nacl、peg-6000、壬基酚聚氧乙烯醚、bsa、nan3、化學(xué)阻斷劑以及生物阻斷劑；

6、所述第二檢測試劑包括ckmb致敏膠乳顆粒、hepes緩沖液、封閉劑、吐溫-20以及nan3。

7、進(jìn)一步的，所述封閉劑包括甘氨酸、hsa和蔗糖。

8、進(jìn)一步的，所述ckmb致敏膠乳顆粒包括粒徑為185nm的羧基膠乳顆粒和359nm的羧基膠乳顆粒。

9、進(jìn)一步的，所述185nm的羧基膠乳顆粒和所述359nm的羧基膠乳顆粒的體積比10:1。

10、進(jìn)一步的，所述化學(xué)阻斷劑包括十二烷基硫酸鈉；和/或

11、所述生物阻斷劑包括羊抗人i?gg。

12、進(jìn)一步的，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)，所述第一檢測試劑的hepes緩沖液的濃度為10～30mmol/l，所述nacl的濃度為10～50g/l，所述peg-6000的濃度為10～30g/l，所述壬基酚聚氧乙烯醚的濃度為1～10g/l，所述化學(xué)阻斷劑的濃度為1～10g/l，所述bsa的濃度為1～5g/l，所述nan3的濃度為0.1％以及所述生物阻斷劑的濃度為0.02％～0.04％；和/或

13、所述第二檢測試劑的hepes緩沖液的濃度為10～30mm，所述ckmb致敏膠乳顆粒的濃度為2～4g/l、所述封閉劑的濃度為1％～5％、所述吐溫-20的濃度為0.1％～1％以及所述nan3的濃度為0.1％。

14、進(jìn)一步的，所述第二檢測試劑通過下述步驟制得：

15、將放置有磁性轉(zhuǎn)子的燒杯置于磁力攪拌器上，依次加入185nm膠乳顆粒和359nm羧基膠乳顆粒，對所述185nm膠乳顆粒和359nm羧基膠乳顆粒進(jìn)行活化處理；

16、加入ckmb抗體，室溫反應(yīng)2～4小時(shí)，加入封閉劑，室溫反應(yīng)1-4小時(shí)；

17、12000rmp離心30min，棄上清液，得到ckmb致敏膠乳顆粒；

18、重懸所述ckmb致敏膠乳顆粒，加入hepes、海藻糖、nan3，得到所述第二檢測試劑。

19、進(jìn)一步的，所述對所述185nm膠乳顆粒和359nm羧基膠乳顆粒進(jìn)行活化處理的步驟包括：

20、加入hepes緩沖溶液、5～20g/l的nhs和5～20g/l的edc，進(jìn)行活化處理。

21、進(jìn)一步的，所述活化時(shí)間為20～40min。

22、為了解決上述技術(shù)問題，本申請實(shí)施例還提供一種上述試劑盒在非診斷目的檢測肌酸激酶同工酶中的應(yīng)用，采用了如下所述的技術(shù)方案：

23、上述試劑盒在非診斷目的檢測肌酸激酶同工酶中的應(yīng)用

24、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本申請實(shí)施例主要有以下有益效果：

25、本申請優(yōu)化了封閉劑種類及用量，包被肌酸激酶同工酶抗體的致敏膠乳分散穩(wěn)定性好，不容易碰撞聚集沉淀。優(yōu)化了球比例與工藝過程，提高試劑的線性和靈敏度，線性可達(dá)0.5～300ng/ml。提高試劑抗甘油三脂的能力。本申請第一檢測試劑采用化學(xué)阻斷劑(十二烷基硫酸鈉)和生物阻斷劑聯(lián)用，針對對高濃度內(nèi)源干擾和常規(guī)含量的內(nèi)源干擾因素，消除標(biāo)本中類風(fēng)濕因子等引起的干擾和交叉反應(yīng)，降低假陽性，提升了試劑抗類風(fēng)濕因子的干擾能力。

技術(shù)特征：

1.一種檢測肌酸激酶同工酶的試劑盒，其特征在于，包括：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測肌酸激酶同工酶的試劑盒，其特征在于，所述封閉劑包括甘氨酸、hsa和蔗糖。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測肌酸激酶同工酶的試劑盒，其特征在于，所述ckmb致敏膠乳顆粒包括粒徑為185nm的羧基膠乳顆粒和359nm的羧基膠乳顆粒。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測肌酸激酶同工酶的試劑盒，其特征在于，所述185nm的羧基膠乳顆粒和所述359nm的羧基膠乳顆粒的體積比10:1。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測肌酸激酶同工酶的試劑盒，其特征在于，所述化學(xué)阻斷劑包括十二烷基硫酸鈉；和/或

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測肌酸激酶同工酶的試劑盒，其特征在于，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)，所述第一檢測試劑的hepes緩沖液的濃度為10～30mmol/l，所述nacl的濃度為10～50g/l，所述peg-6000的濃度為10～30g/l，所述壬基酚聚氧乙烯醚的濃度為1～10g/l，所述化學(xué)阻斷劑的濃度為1～10g/l，所述bsa的濃度為1～5g/l，所述nan3的濃度為0.1％以及所述生物阻斷劑的濃度為0.02％～0.04％；和/或

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測肌酸激酶同工酶的試劑盒，其特征在于，所述第二檢測試劑通過下述步驟制得：

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測肌酸激酶同工酶的試劑盒，其特征在于，所述對所述185nm膠乳顆粒和359nm羧基膠乳顆粒進(jìn)行活化處理的步驟包括：

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的檢測肌酸激酶同工酶的試劑盒，其特征在于，所述活化時(shí)間為20～40min。

10.如權(quán)利要求9所述的試劑盒在非診斷目的檢測肌酸激酶同工酶中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本申請實(shí)施例屬于檢測技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種檢測肌酸激酶同工酶的試劑盒及應(yīng)用，包括第一檢測試劑和第二檢測試劑；所述第一檢測試劑包括Hepes緩沖液、NaCl、PEG?6000、壬基酚聚氧乙烯醚、BSA、NaN<subgt;3</subgt;、化學(xué)阻斷劑以及生物阻斷劑；所述第二檢測試劑包括CKMB致敏膠乳顆粒、Hepes緩沖液、封閉劑、吐溫?20以及NaN<subgt;3</subgt;。本申請有效提高對肌酸激酶同工酶的檢測靈敏度。

技術(shù)研發(fā)人員：謝龍,齊文闖,蔣析文,劉瓊,段少卿,盧華丹
受保護(hù)的技術(shù)使用者：廣州達(dá)安基因股份有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/9