本領(lǐng)域涉及glp-1檢測，特別涉及一種測定利拉魯肽及特定雜質(zhì)的高效液相色譜方法。

背景技術(shù)：

1、利拉魯肽，英文名稱為liraglutide，是由丹麥諾和諾德公司開發(fā)生產(chǎn)的一種新型長效胰高血糖素樣肽-1(glp-1)類似物，用于治療ii型糖尿病。利拉魯肽具有降血糖、減肥、降低糖尿病患者主要不良心血管事件風(fēng)險的功效，最早于2007年9月在歐盟批準(zhǔn)上市。

2、利拉魯肽將人體glp-1(7-36)的lys34替換成arg，并且在lys26側(cè)鏈上連接一條16碳棕櫚脂肪酸衍生而來?；瘜W(xué)合成的利拉魯肽為31肽，分子式為c172h265n43o51，分子量為3751.20g/mol。外觀為白色至類白色粉末或疏松塊狀物。肽序列為：

3、h-his1-ala2-glu3-gly4-thr5-phe6-thr7-ser8-asp9-val10-ser11-ser12-tyr13-leu14-glu15-gly16-gln17-ala18-ala19-lys20(n-ε-(γ-glu(n-α-pal))-glu21-phe22-ile23-ala24-trp25-leu26-val27-arg28-gly29-arg30-gly31-oh。

4、多肽主要由氨基酸(包括天然氨基酸和非天然氨基酸)構(gòu)成，這使得多肽類藥物在質(zhì)量研究方面不同于一般藥物。由于合成工藝、結(jié)構(gòu)等方面的獨特性，合成多肽原料藥中工藝雜質(zhì)的來源和一般化學(xué)藥物有所不同，其可能產(chǎn)生的工藝雜質(zhì)有：缺失肽、錯接肽、斷裂肽、去酰胺多肽、氨基酸側(cè)鏈的不完全脫保護所形成的副產(chǎn)物、氧化肽、二硫鍵交換的產(chǎn)物、非對映異構(gòu)的多肽等。同時，由于多肽的結(jié)構(gòu)特點，這類藥物的穩(wěn)定性相對較差，引起多肽藥物不穩(wěn)定的原因主要有水解、氧化、外消旋化、二硫鍵的斷裂及重排、β消除等。因此，在合成多肽藥物的有關(guān)物質(zhì)檢查方法的研究中需要充分考慮對工藝雜質(zhì)與降解雜質(zhì)的檢出效能。

5、化學(xué)合成的利拉魯肽，在合成及儲存過程中，不可避免地產(chǎn)生一系列的工藝雜質(zhì)和降解雜質(zhì)，如[d-ser12]雜質(zhì)(雜質(zhì)a)、[d-his1]雜質(zhì)(雜質(zhì)d)、[d-ser8]雜質(zhì)(雜質(zhì)b)，[ile26]雜質(zhì)(雜質(zhì)f)，[des-his1-ala2]雜質(zhì)(雜質(zhì)e)。其中雜質(zhì)a、雜質(zhì)d、雜質(zhì)b、雜質(zhì)f在工藝過程中產(chǎn)生，因這些雜質(zhì)與利拉魯肽在結(jié)構(gòu)上僅有一個氨基酸不同，其性質(zhì)與利拉魯肽極其相近，純化難以去除；同時因利拉魯肽呈堿性，在存放過程中容易發(fā)生消旋，產(chǎn)生雜質(zhì)a、雜質(zhì)d、雜質(zhì)b、雜質(zhì)e，所以在利拉魯肽的原料藥與制劑中需要嚴(yán)格控制雜質(zhì)含量，否則，一旦這些雜質(zhì)超出限度將影響藥品的質(zhì)量，帶來藥品安全風(fēng)險。然而這些雜質(zhì)或為利拉魯肽消旋雜質(zhì)、缺失肽雜質(zhì)或錯接肽雜質(zhì)，在性質(zhì)上與利拉魯肽極為接近，較難與主峰分離，對其進行含量測定存在一定難度，因此，需要開發(fā)一種能有效分離這些雜質(zhì)并對其進行含量測定的方法。目前，沒有任何藥典收載利拉魯肽有關(guān)物質(zhì)的檢測方法，現(xiàn)有專利及文獻對于利拉魯肽有關(guān)物質(zhì)的檢測方法的報道較少，中國專利cn107290438a提供了一種利拉魯肽有關(guān)物質(zhì)的檢測方法，但該方法未涉及任何特定雜質(zhì)的分離，且主峰拖尾因子大于2.0，拖尾嚴(yán)重。

6、由于這些有關(guān)雜質(zhì)的毒理數(shù)據(jù)尚不明確，對于患者用藥必然存在一定的潛在的風(fēng)險。因此，為了保證利拉魯肽產(chǎn)品質(zhì)量，提高患者用藥安全性，對利拉魯肽中這些特定雜質(zhì)進行嚴(yán)格的質(zhì)量控制具有非常重要的意義。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種測定利拉魯肽及特定雜質(zhì)的高效液相色譜方法，在特定的色譜條件下，能夠同時有效分離利拉魯肽及5種特定雜質(zhì)，并對利拉魯肽及其雜質(zhì)含量進行定量測定，且靈敏度高，能有效控制利拉魯肽產(chǎn)品的質(zhì)量。

2、為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了一種測定利拉魯肽及特定雜質(zhì)的高效液相色譜方法，包括以下步驟：

3、采用c8色譜柱；以磷酸鹽緩沖溶液-乙腈的混合溶液，并調(diào)ph至4.8～5.0，作為流動相；洗脫方式：梯度洗脫。

4、所述特定雜質(zhì)包括：雜質(zhì)a、雜質(zhì)b、雜質(zhì)d、雜質(zhì)e、雜質(zhì)f，肽序如下：

5、雜質(zhì)a：h-his-ala-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-val-ser-d-ser-tyr-leu-glu-gly-gln-ala-ala-lys(pal-γ-glu)-glu-phe-ile-ala-trp-ieu-val-arg-gly-arg-gly-oh

6、雜質(zhì)b：h-his-ala-glu-gly-thr-phe-thr-d-ser-asp-val-ser-ser-tyr-leu-glu-gly-gln-ala-ala-lys(pal-γ-glu)-glu-phe-ile-ala-trp-leu-val-arg-gly-arg-gly-oh

7、雜質(zhì)d：h-d-his-ala-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-val-ser-ser-tyr-leu-glu-gly-gln-ala-ala-lys(pal-γ-glu)-glu-phe-ile-ala-trp-leu-val-arg-gly-arg-gly-oh

8、雜質(zhì)e：h-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-val-ser-ser-tyr-leu-glu-gly-gln-ala-ala-lys(pal-γ-glu)-glu-phe-ile-ala-trp-leu-val-arg-gly-arg-gly-oh

9、雜質(zhì)f：h-his-ala-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-val-ser-ser-tyr-leu-glu-gly-gln-ala-ala-lys(pal-γ-glu)-glu-phe-ile-ala-trp-ile-val-arg-gly-arg-gly-oh

10、本發(fā)明中，色譜柱為c8色譜柱。不同填料的色譜柱，對雜質(zhì)分離有著極其重要的影響，甚至影響雜質(zhì)的出峰順序。優(yōu)選色譜柱規(guī)格為250×4.6mm，填料粒徑為3～3.5μm，相比較粒徑為5μm的色譜柱而言，粒徑更小，理論塔板數(shù)更高，對改善峰型及提高分離度更有利。

11、本發(fā)明中，流動相為磷酸鹽緩沖溶液-乙腈混合溶液。不同的緩沖鹽體系對主峰及雜質(zhì)的分離效果不一樣，同時對主峰峰型及基線有不同程度的影響，如主峰前沿或拖尾則無法判斷雜質(zhì)是否與與主峰分離，以磷酸鹽緩沖溶液-乙腈為流動相體系，雜質(zhì)的分離效果好，主峰峰型好。根據(jù)本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方式，所述流動相中磷酸鹽緩沖溶液的濃度為10～50mmol/l。由于使用的緩沖鹽濃度包含高濃度范疇，因此本發(fā)明在流動相中預(yù)先混入一定比例的乙腈，此操作有利于儀器平衡使基線波動更穩(wěn)定。

12、本發(fā)明的一些具體實施例中，流動相ph范圍為4.8～5.0。不同ph能改變前后雜質(zhì)與主峰的分離度，甚至影響雜質(zhì)的出峰順序，其中，ph在4.8～5.0時主峰與前后雜質(zhì)的分離能達(dá)到良好的分離效果，主峰峰形良好，雜質(zhì)出峰順序穩(wěn)定。

13、本發(fā)明的一些具體實施例中，色譜柱的柱溫為40℃～47℃。柱溫過低系統(tǒng)壓力較大；柱溫過高前后雜分離度較小；更優(yōu)選柱溫為45℃。

14、本發(fā)明的一些具體實施例中，流動相流速為：0.7～0.9ml/min，更優(yōu)選為0.8ml/min。

15、本發(fā)明的一些具體實施例中，洗脫梯度為流動相b：26±2％→72±2％(0-60min)→72±2％(60-90min)，更優(yōu)選為26％→72％(0-60min)→72％(60-90min)。

16、本發(fā)明的積極進步效果在于：

17、本發(fā)明方法能夠同時有效分離利拉魯肽及其5個特定雜質(zhì)，首次將利拉魯肽和5種特定雜質(zhì)在一個分析體系中完成，各雜質(zhì)峰之間及主峰與相鄰雜質(zhì)峰之間的分離度均大于1.0。利用本發(fā)明方法采用雜質(zhì)對照法對利拉魯肽及5個特定雜質(zhì)的檢測限、定量限進行檢測，結(jié)果表明該方法對利拉魯肽及各雜質(zhì)均能進行定量檢測，具有專屬性強、分離度好、分析速度快、靈敏度高等特點，可用于利拉魯肽原料藥和制劑有關(guān)物質(zhì)的檢測，同時也可以用于利拉魯肽含量的檢測。解決了目前國內(nèi)外藥典及文獻中沒有控制利拉魯肽特定雜質(zhì)方法的技術(shù)問題，實現(xiàn)利拉魯肽生產(chǎn)工藝中主要工藝雜質(zhì)和潛在降解雜質(zhì)的精確控制，提高利拉魯肽產(chǎn)品的質(zhì)量。