本發(fā)明涉及一種用于確定介質(zhì)流過的樣品室中的流動特性的方法。本發(fā)明還涉及一種適于執(zhí)行該方法的顯微鏡。

背景技術(shù)：

1、在顯微鏡領(lǐng)域中，特別是在共焦激光掃描顯微鏡領(lǐng)域中，感興趣的是識別樣品室中物體的移動并確定它們的性質(zhì)，例如速度和方向。這里特別感興趣的是提供關(guān)于流動分布的數(shù)據(jù)，例如以便評估樣品室的設(shè)計(jì)的影響，例如管、反應(yīng)室或細(xì)胞培養(yǎng)室(“芯片實(shí)驗(yàn)室”；“芯片上的器官”)中的小型化反應(yīng)室(腔體)。

2、de?10?2023?201?620(未公開)公開了一種用于研究分子運(yùn)動的方法。這里使用熒光相關(guān)光譜(fcs)的方法，例如，以研究細(xì)胞中分子行為的動力學(xué)。該方法，也簡稱為fcs，可以以各種變體獲得(例如：lenne等人，2006，embo?j.25：3245-3256和wenger等人，2007，biophys.j.92：913-919)。變體之一是被稱為“斑點(diǎn)變異fcs”的變體(例如：wawreznieck等人,2005,biophys.j.89:4029-4042)。這里，激發(fā)輻射被聚焦并引導(dǎo)到樣品室中。由于激發(fā)輻射的聚焦光束的聚焦和聚焦范圍相對于傳播方向(通常是光軸)橫向(x或y方向)和沿著傳播方向(z方向)的聚焦，在樣品室中結(jié)合共焦檢測照射所謂的共焦體積(為了簡化，在本文中也稱為“焦點(diǎn)”)?？梢葬槍Σ煌叽绲墓步贵w積獲取多條亮度信息(測量值)。借助于光學(xué)檢測器(例如，光電二極管)獲取亮度信息。

3、從scipioni等人的出版物(2018；nature?communications,doi：10.1038/s41467-018-07513-2)中，已知斑點(diǎn)變化fcs的變化。為了檢測目的，使用空間分辨表面檢測器，其檢測器元件可以單獨(dú)地且彼此獨(dú)立地讀取和評估。具體地，在scipioni等人中使用稱為“airyscan檢測器”的檢測器類型；它被布置在檢測光束路徑的中間像平面中，并且其相應(yīng)的檢測器元件用作單獨(dú)的針孔(huff，2015，nature?methods，application?notes，2015年12月)。

4、de?10?2023?201?620描述了從這種二維檢測器的選定對中有針對性地讀取測量值?；ハ嚓P(guān)可用于確定生物細(xì)胞內(nèi)發(fā)射熒光輻射形式的檢測輻射的移動分子的速度和方向。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提出一種用于確定介質(zhì)流過的樣品室中的流動特性的可能性，特別是在具有小尺寸的樣品室中。

2、該目的通過下文所述來實(shí)現(xiàn)。下文還涉及有利的發(fā)展。

3、本發(fā)明提供了一種用于確定介質(zhì)流過的樣品室中的流動特性的方法，所述方法包括以下步驟：

4、-a.在測量周期內(nèi)的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)，利用檢測器陣列形式的檢測器的多個(gè)檢測器元件檢測在所述樣品室中產(chǎn)生的來自共焦體積的檢測輻射，其中所述檢測器布置在與物鏡的后側(cè)像平面共軛的平面中，并且能夠單獨(dú)分析來自所述檢測器元件的測量值；以及選擇至少一對檢測器元件，一對中的每個(gè)伙伴由至少一個(gè)檢測器元件形成；

5、-b.創(chuàng)建來自所述檢測器元件中的至少一對檢測器元件的所獲取的測量值的互相關(guān)，其中

6、在第一子步驟b1中，從選擇的檢測器元件中的一個(gè)開始在第一方向上到另一選擇的檢測器元件來計(jì)算互相關(guān)；

7、-并且在第二子步驟b2中，從所述另一選擇的檢測器元件開始在第二方向(向后方向)上到第一選擇的檢測器元件來額外地計(jì)算互相關(guān)；以及

8、-在步驟c中，關(guān)于來自選擇的檢測器元件的測量值的強(qiáng)度變化的發(fā)生來分析所述互相關(guān)，

9、其中，

10、-在所述樣品室的至少兩個(gè)相互不同的位置處產(chǎn)生所述共焦體積，并且

11、-在所述位置中的每一個(gè)位置處，借助于在具有不同對準(zhǔn)的對上計(jì)算的多個(gè)互相關(guān)，基于所述互相關(guān)，將速度和可選的移動方向確定為所述介質(zhì)的流動特性，并且將由此獲得的所有曲線以所述方向和/或速度作為參數(shù)進(jìn)行擬合，以及

12、-并且每個(gè)位置的速度和在適當(dāng)?shù)那闆r下的移動方向被分配給彼此并可檢索地存儲，以便在所述樣品室的至少一個(gè)區(qū)域上產(chǎn)生速度剖面。

13、在一實(shí)施方式中，多個(gè)檢測器元件被組合以形成擴(kuò)展對的伙伴中的相應(yīng)一個(gè)。

14、在一實(shí)施方式中，限定一組多對或多個(gè)擴(kuò)展對的檢測器元件，其中所述對或擴(kuò)展對的中心點(diǎn)的假想連接線彼此平行延伸。

15、在一實(shí)施方式中，形成由來自所述對或擴(kuò)展對的測量值創(chuàng)建的所述第一方向和/或所述第二方向的互相關(guān)的平均值。

16、在一實(shí)施方式中，確定多組檢測器元件，其中所述組之間的相應(yīng)假想連接線彼此不同地對齊。

17、在一實(shí)施方式中，形成來自至少兩個(gè)不同組的對或擴(kuò)展對的測量值的互相關(guān)。

18、在一實(shí)施方式中，在每種情況下，一對中的伙伴由不屬于所關(guān)注對的至少一個(gè)檢測器元件在空間上分開。

19、在一實(shí)施方式中，用于產(chǎn)生所述共焦體積并沿著照明光束路徑被引導(dǎo)到所述樣品室中的照明輻射和/或所檢測的檢測輻射的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)在橫向于相應(yīng)光束路徑的方向上被拉伸，使得其具有橢圓形橫截面。

20、在一實(shí)施方式中，所述樣品室在x、y和z的至少一個(gè)方向上由壁界定，并且從所述壁開始，至少在所述樣品室的橫截面的一部分上，選擇多個(gè)位置，并且在每種情況下在那里產(chǎn)生共焦體積。

21、本發(fā)明還提供了根據(jù)前述中任一項(xiàng)所述的方法的用途，用于通過將所述壁的特性設(shè)定為與所確定的流動特性的關(guān)系來確定所述樣品室的壁對至少一個(gè)速度剖面的影響。

22、本發(fā)明還提供了根據(jù)前述中任一項(xiàng)所述的方法的用途，其中生物結(jié)構(gòu)用作樣品室，其中，通過將修改的壁的特性設(shè)置成與確定的流動特性的關(guān)系來確定用植入物修改的樣品室的壁對至少一個(gè)速度剖面的影響。

23、本發(fā)明還提供了根據(jù)前述中任一項(xiàng)所述的方法的用途，用于提供測量值作為模型的輸入數(shù)據(jù)和/或用于驗(yàn)證現(xiàn)有模擬。

24、本發(fā)明還提供了一種用于確定介質(zhì)流過的樣品室中的流動特性的顯微鏡，包括：

25、-物鏡，用于檢測來自在所述樣品室中生成的共焦體積的檢測輻射；

26、-檢測光束路徑，所檢測的檢測輻射沿著所述檢測光束路徑被引導(dǎo)到具有多個(gè)檢測器元件的檢測器陣列形式的檢測器，其中所述檢測器被布置在與所述物鏡的后側(cè)像平面共軛的平面中，并且來自所述檢測器元件的測量值能夠各自被單獨(dú)讀取；

27、-分析和控制單元，其被配置用于執(zhí)行根據(jù)上文中任一項(xiàng)所述的方法。

28、根據(jù)本發(fā)明的用于確定介質(zhì)流過的樣品室中的流動特性的方法包括以下步驟。在步驟a中，檢測源自樣品室中產(chǎn)生的共焦體積的檢測輻射。利用檢測器陣列的多個(gè)檢測器元件在測量周期(也是：測量周期、測量間隔；例如，在每種情況下每個(gè)測量持續(xù)時(shí)間10秒到幾分鐘)內(nèi)的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)處執(zhí)行檢測，其中檢測器陣列被布置在與物鏡的后側(cè)像平面共軛的平面中。該共軛平面也稱為“針孔平面”。來自檢測器元件的測量值可以各自在單獨(dú)的基礎(chǔ)上被讀取和分析。還可以將來自相應(yīng)的選擇的檢測器元件的測量值彼此組合(“分箱(binning)”)。

29、此外，選擇至少一對檢測器元件，其中一對中的兩個(gè)伙伴中的每一個(gè)由至少一個(gè)檢測器元件形成。一對由至少一個(gè)選擇的檢測器元件和另一選擇的檢測器元件形成。

30、在另一方法步驟(步驟b)中，所獲取的測量值的互相關(guān)是從它們之間的至少一對的測量值創(chuàng)建的。在該過程中，在第一子步驟b1中，從選擇的檢測器元件中的一個(gè)開始在第一方向上到另一選擇的檢測器元件來計(jì)算互相關(guān)。該第一方向也可以被稱為向前方向。

31、在第二子步驟b2中，從另一選擇的檢測器元件開始在第二方向(向后方向)上到第一選擇的檢測器元件來額外地計(jì)算互相關(guān)。

32、在步驟c中，關(guān)于來自選擇的檢測器元件的測量值的強(qiáng)度變化的發(fā)生來分析互相關(guān)或其結(jié)果。

33、根據(jù)本發(fā)明的方法的特征在于，在樣品室的至少兩個(gè)相互不同的位置處產(chǎn)生共焦體積。為了解決不同的位置，共焦體積在此可以可選地重疊它們在z方向上的范圍的至多50％或它們在x方向上和/或在y方向上至z方向的橫截面上的范圍的至多50％。

34、在本說明書中，根據(jù)笛卡爾坐標(biāo)系，樣品室中的介質(zhì)的主流的方向被稱為方向x，并且與其正交的方向被稱為方向y。z軸(方向z)垂直于兩個(gè)方向，并且通常沿其檢測檢測輻射。

35、進(jìn)行測量的位置可以手動選擇，例如使用適當(dāng)?shù)挠脩艚缑?，或者自動選擇。例如，用戶可以指定規(guī)則，根據(jù)該規(guī)則來確定位置的數(shù)量和定位。例如，這里可以選擇絕對位于樣品室中的位置或分別相對于位于樣品室中的樣品的位置。還可以使用先前獲取的樣品室和/或樣品的概覽圖像來選擇位置。如本文所提及的樣品是人工或生物結(jié)構(gòu)，其位于樣品室中并且介質(zhì)朝向其流動和/或被介質(zhì)包圍。人工結(jié)構(gòu)主要由技術(shù)材料如金屬、合金和塑料構(gòu)成，但任選地也由生物源材料構(gòu)成，并且可以是例如血管植入物。生物結(jié)構(gòu)包括例如細(xì)胞、細(xì)胞層、球狀體、類器官和生物體或整個(gè)生物體的組織。

36、在每個(gè)位置處，基于互相關(guān)借助于多個(gè)互相關(guān)來確定介質(zhì)的速度和可選的移動方向，特別地，在具有不同對準(zhǔn)的對上計(jì)算多個(gè)互相關(guān)，并且由此獲得的所有曲線以方向和/或速度作為參數(shù)來擬合。

37、每個(gè)位置的速度和在適當(dāng)?shù)那闆r下的移動方向被分配給彼此并可檢索地存儲，以便在樣品室的至少一個(gè)空間區(qū)域上創(chuàng)建速度剖面，或者如果添加相應(yīng)的移動方向，則創(chuàng)建流動剖面。

38、在本說明書中，在具有起點(diǎn)和虛擬傳播線的向量的意義上，結(jié)合互相關(guān)的計(jì)算使用術(shù)語方向。這意味著在水平方向上，例如，第一方向(向前方向)從起點(diǎn)朝向0°延伸，并且第二方向(向后方向)從起點(diǎn)朝向180°延伸(也參見圖4)。相應(yīng)的語句適用于具有不同對準(zhǔn)的(極)坐標(biāo)系。

39、本發(fā)明的核心是使用來自所選擇的并且特別是單獨(dú)可讀的檢測器元件的測量值來獲得流動介質(zhì)中的流動的信息，例如通過特定物體的移動，并且因此產(chǎn)生在樣品室的至少一個(gè)區(qū)域上的流動剖面。對于每個(gè)測量點(diǎn)(位置)，這里確定當(dāng)前達(dá)到那里的速度以及可選地確定物體的移動方向。為了簡化問題，以下文本將涉及流動剖面，即使僅可以創(chuàng)建速度剖面。從多個(gè)不同測量點(diǎn)的測量值生成流動剖面。組合成流動剖面的測量值有利地在限定的測量時(shí)段內(nèi)確定，以便確保它們的相互作用或它們的同時(shí)存在。在本說明書的范圍內(nèi)，物體是指分子，特別是例如蛋白質(zhì)、核酸及其衍生物、聚集體、復(fù)合物、聚合物和螯合物。

40、用于確定流動性質(zhì)的物體優(yōu)選地用熒光團(tuán)標(biāo)記，或者它們本身能夠發(fā)射熒光輻射(熒光團(tuán))。被檢測為檢測輻射的發(fā)射的熒光輻射特別是借助于輻射到樣品室中的激發(fā)輻射引起。

41、為了保存樣品室中的樣品和/或介質(zhì)中的物體，在每種情況下，激發(fā)輻射被成形并僅引導(dǎo)到樣品室的選定區(qū)域中。局部激發(fā)有利地與相應(yīng)位置處的檢測輻射的檢測同步。

42、有利地，適用于產(chǎn)生共焦體積的光學(xué)裝置(例如顯微鏡)的現(xiàn)有配置可以用于本發(fā)明的實(shí)施例，以便在沒有額外設(shè)備費(fèi)用的情況下確定數(shù)據(jù)。這里使用每個(gè)檢測器元件對共焦體積的略微不同的部分成像的情況。因此，生成多個(gè)相互不同的檢測焦點(diǎn)并分析它們的測量值，其中檢測器元件以及其上游的光學(xué)元件(例如微透鏡陣列，在所謂的airyscan檢測器(huff，2015，nature?methods；application?notes，2015年12月)和spad(單光子雪崩二極管)檢測器陣列中)的非常高精度的制造和布置有利地需要非常精確地了解相應(yīng)共焦體積的距離。與現(xiàn)有技術(shù)的解決方案相比，關(guān)于相應(yīng)共焦體積的位置和性質(zhì)的確切知識有利地允許省去其校準(zhǔn)，例如使用已知的染料分子作為參考。

43、下面基于具有32個(gè)通道的airyscan檢測器(huff，2015，nature?methods；application?notes，2015年12月)通過示例的方式解釋根據(jù)本發(fā)明的基本過程。適用于實(shí)施本發(fā)明的另外的檢測器是例如spad陣列和具有單獨(dú)可讀或組合(“分箱”)檢測器元件的其他表面檢測器。

44、如通過圖4的示例可以收集到的，如果在形成一對的檢測器元件之間保留相應(yīng)的檢測器元件間隔并且如果外部檢測器元件未被使用(參見下文)，則airyscan檢測器的使用允許計(jì)算六個(gè)互相關(guān)。在這種情況下，針對相反方向計(jì)算的互相關(guān)之間的差異指示引起或發(fā)射檢測輻射的物體的移動。

45、為了確定移動物體的速度和方向，可以創(chuàng)建關(guān)于等式[1]指定的形式的實(shí)驗(yàn)互相關(guān)或借助于更詳細(xì)的模型。

46、與[1]相關(guān)的等式是：

47、

48、其中v是流速(擬合參數(shù))；α是流動方向和連接檢測器元件的矢量之間的角度(擬合參數(shù))；r0是(擴(kuò)展)對的檢測器元件的焦點(diǎn)之間的距離；w0是檢測器元件的共焦體積在xy中的1/e2半徑；d是擴(kuò)散系數(shù)，gdiff(τ)是擴(kuò)散項(xiàng)(2-d或3-d)。后者描述了在沒有檢測器元件的移動的情況下的自相關(guān)。

49、不能直接從檢測器元件之間的間隔計(jì)算參數(shù)r0；相反，它必須憑經(jīng)驗(yàn)或理論確定。其原因可以在照射輻射的psf(點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù))和檢測輻射的psf不相同的情況下找到。一方面，參數(shù)r0可以借助于被測量的靜態(tài)樣本(例如顏色解)來確定，其中r0作為待擬合的參數(shù)被插入，并且流速被設(shè)定為v＝0。可替代地，可以從理論psf導(dǎo)出r0，例如通過使用與理論psf的互相關(guān)并借助于等式[1]調(diào)整(“擬合”)它們。

50、針對不同方向擬合多個(gè)互相關(guān)改善了關(guān)于角度α的擬合的穩(wěn)定性。與具有兩個(gè)焦點(diǎn)的現(xiàn)有技術(shù)方法相反，所有互相關(guān)也可以從單組測量值確定。

51、在另一種方法配置中，可以組合多個(gè)檢測器元件以在每種情況下形成一對的部件或伙伴中的相應(yīng)一個(gè)；這在下文中稱為擴(kuò)展對。在這種情況下，在確定擴(kuò)展對的兩個(gè)伙伴的由此數(shù)學(xué)組合的測量值之間的互相關(guān)之前，將所獲取的擴(kuò)展對的每個(gè)伙伴的測量值進(jìn)行數(shù)學(xué)組合，例如平均。

52、根據(jù)本發(fā)明的方法可以僅使用一對或一擴(kuò)展對的檢測器元件來實(shí)現(xiàn)。為了提高信噪比，可以在另一配置中定義一組多對和/或擴(kuò)展對的檢測器元件。在這種情況下，每對或擴(kuò)展對的中心點(diǎn)的假想連接線基本上彼此平行地延伸。盡管假想連接線可以(僅作為示例)在不同檢測器元件的中心點(diǎn)處開始，但是它們都例如朝向0°延伸(也參見圖5)。在對每對獲取的測量值進(jìn)行平均之后，可以再次將等式[1]應(yīng)用于來自由此選擇的對的測量值。類似的情況適用于第二方向，即向后方向，例如朝向180°。在這些情況下，向前方向也可以被稱為共同的第一方向，并且向后方向也可以被稱為共同的第二方向。

53、特別地，對于更深入的分析和/或計(jì)算，可以在每種情況下形成由來自對或擴(kuò)展對的測量值創(chuàng)建的第一方向和/或第二方向上的互相關(guān)的平均值，并且可選地保存以供進(jìn)一步使用。

54、根據(jù)本發(fā)明的方法的優(yōu)點(diǎn)在于，可以同時(shí)分析多個(gè)對或擴(kuò)展對的情況。在這種情況下有利地分析成組的對或擴(kuò)展對，其中每個(gè)組的(擴(kuò)展)對之間的假想連接線的相應(yīng)共同方向彼此不同地對齊。

55、基于互相關(guān)的結(jié)果，還可以有利地確定被激發(fā)用于熒光輻射的發(fā)射的物體的當(dāng)前濃度。

56、在根據(jù)本發(fā)明的方法的有利配置中，可以計(jì)算多個(gè)互相關(guān)，例如，在具有不同對齊的對/擴(kuò)展對上，例如至少兩個(gè)不同的組，或它們的平均值(參見上文)?？蛇x地，因此獲得的所有曲線可以用相應(yīng)的方向和/或速度作為參數(shù)進(jìn)行擬合(全局?jǐn)M合)。

57、當(dāng)選擇相應(yīng)對/擴(kuò)展對的檢測器元件時(shí)，可以通過所選擇的對在每種情況下由不屬于所關(guān)注的對的至少一個(gè)檢測器元件在空間上分離來映射足夠的擴(kuò)散路徑或流動路徑。因此，屬于擴(kuò)展對的檢測器元件可以被選擇為彼此遠(yuǎn)離至少與檢測器元件的寬度相對應(yīng)的距離。

58、如下面將解釋的，可以特別地選擇具有足夠相似的共焦體積半徑并且彼此距離相同的檢測器元件。然而，使用來自外圍檢測器元件的針對局部速度和移動方向的測量值獲得的結(jié)果也已被證明是有效且穩(wěn)健的。

59、為了提高根據(jù)本發(fā)明的方法的效率，可以使照明輻射和/或檢測到的檢測輻射的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)(psf)成形，該照明輻射用于產(chǎn)生共焦體積并且沿著照明光束路徑被引導(dǎo)到樣品室中，使得特別地，被提供或適合作為用于后續(xù)分析的對或擴(kuò)展對的伙伴的檢測器元件獲取測量值。

60、例如，照明光束路徑的橫截面可以在橫向于相應(yīng)光束路徑的方向上拉伸，使得其具有細(xì)長橢圓形橫截面。這種光束整形可以通過合適的狹縫光闌或通過適當(dāng)控制的空間光調(diào)制器(slm)的效果來實(shí)現(xiàn)。

61、可選地，可以基于通過根據(jù)本發(fā)明的方法確定的數(shù)據(jù)，特別是基于互相關(guān)的結(jié)果來導(dǎo)出移動物體的其他特性。因此，有利地可以在檢測輻射的原點(diǎn)處確定介質(zhì)(例如樣品的基質(zhì)或溶劑)的局部溫度(微溫度)。

62、此外，可以確定檢測輻射的原點(diǎn)處的介質(zhì)的粘度，更精確地確定檢測輻射的相應(yīng)分量的粘度。例如，基礎(chǔ)是也被稱為愛因斯坦-斯托克斯方程[2]的方程：

63、d(t)＝kbt/(6πη(t)r)[2].

64、其中：

65、d是擴(kuò)散系數(shù)，

66、kb是玻爾茲曼常數(shù)，

67、t是絕對溫度，

68、η是介質(zhì)的動態(tài)粘度，并且

69、r是物體的流體動力學(xué)半徑(斯托克斯半徑)。

70、關(guān)系的元素的多個(gè)溫度依賴性從等式[2]中顯而易見。例如，在恒定溫度t和壓力出現(xiàn)變化的情況下，可以確定粘度η或其變化。

71、本發(fā)明可以有利地用于流過的樣品室，例如管、稱為細(xì)胞培養(yǎng)室的腔、生物芯片、反應(yīng)室、流動室等。這里的樣品室優(yōu)選地是微流體布置或系統(tǒng)的部件。

72、例如，在一種可能的用途中，可以通過將壁的特性設(shè)定為與(相關(guān)聯(lián)的)確定的流動特性有關(guān)系來研究測量區(qū)域中的相應(yīng)樣品室的壁對至少一個(gè)速度剖面的影響。除了確定尺寸之外，壁的材料和/或其表面的宏觀結(jié)構(gòu)化和/或微觀結(jié)構(gòu)化也可以是壁的性質(zhì)。

73、借助于本發(fā)明可以有利地實(shí)現(xiàn)的測量的高空間分辨率允許在非常小的樣品室中確定流動特性并且相應(yīng)地產(chǎn)生小尺度流動剖面。根據(jù)本發(fā)明的方法的空間分辨率由照明體積的衍射受限范圍確定。通過根據(jù)本發(fā)明的方法可實(shí)現(xiàn)的分辨率在方向x和y上小于100nm，特別是約40nm。在z方向上，可以實(shí)現(xiàn)大約10nm的分辨率。

74、在方向z上(即在檢測方向上)的測量值目前可以以足夠的質(zhì)量測量，直到幾毫米的深度，例如小于3mm，例如約1mm，特別是高達(dá)約500μm，這取決于樣品室的壁、介質(zhì)和熒光物體的光學(xué)性質(zhì)。例如，可以生成共焦體積，其中psf定性地適合于評估直到150至200μm的深度(方向z)(在例如400μm的工作距離處)。根據(jù)所涉及的組分的光學(xué)性質(zhì)以及激發(fā)輻射和發(fā)射的檢測輻射的波長，psf在此的表現(xiàn)對于所獲得的數(shù)據(jù)的可獲得質(zhì)量是特別重要的。通過光學(xué)元件的進(jìn)一步改進(jìn)和調(diào)整，可以實(shí)現(xiàn)更大的深度。

75、在本發(fā)明的另一可能的應(yīng)用中，可以研究位于介質(zhì)中的物體(例如移動或(自由)漂浮的單元)的流動行為以及其對樣品室中的流動行為的影響。例如，如果細(xì)胞或組織本身能夠產(chǎn)生流動，例如通過其纖毛，也可以研究產(chǎn)生的流動和/或其與樣品室中存在的任何其他流動的相互作用。

76、流動特性，特別是流動剖面，也可以根據(jù)用作樣品的物體(例如球體、組織、類器官和/或其他三維結(jié)構(gòu))的存在和/或特定尺寸來確定。

77、本發(fā)明的另一個(gè)應(yīng)用是測量生物體的血管或血管系統(tǒng)內(nèi)的體內(nèi)流動特性。例如，這對于斑馬魚是可能的，只要斑馬魚在其發(fā)育期間對于激發(fā)輻射和檢測輻射仍然是光學(xué)透射的。

78、由于可實(shí)現(xiàn)的高空間分辨率，例如，可以在根據(jù)本發(fā)明的方法的應(yīng)用中研究樣品室的壁的修改的影響。因此，可以確定處于未處理狀態(tài)的血管復(fù)制品中的介質(zhì)的流動特性，并將它們與處理狀態(tài)下的流動特性進(jìn)行比較，例如在插入血管植入物(支架)之后。

79、根據(jù)本發(fā)明的方法的另一應(yīng)用領(lǐng)域是基礎(chǔ)生物醫(yī)學(xué)研究。例如，因此可以研究和描述藥理學(xué)活性物質(zhì)在樣品室中的分布及其向生物樣品的供應(yīng)。該方法還可用于材料研究，特別是生物醫(yī)學(xué)材料研究，并且還可用于質(zhì)量控制。還有利的是，一方面可以通過根據(jù)本發(fā)明的方法確定介質(zhì)的流動性質(zhì)和藥理活性物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)行為，并且此外可以使用相同的顯微鏡在生物結(jié)構(gòu)內(nèi)檢測和研究活性物質(zhì)的吸收和位置，例如使用de?10?2023?201?620中描述的方法。為此，樣品室可以有利地簡單地留在顯微鏡的樣品臺上。

80、根據(jù)本發(fā)明的方法可以附加地或替代地用于提供測量值作為模型的輸入數(shù)據(jù)和/或用于驗(yàn)證現(xiàn)有模擬。除了數(shù)學(xué)模擬和模型外，這樣的輸入數(shù)據(jù)還可以例如用于機(jī)器學(xué)習(xí)和人工智能的方法(統(tǒng)稱為模擬和模型)。這兩種方法都可以在樣品室中針對一般情況和單獨(dú)情況來實(shí)施。例如，可以在樣品室中具有或不具有樣品的情況下開發(fā)、改進(jìn)和應(yīng)用模擬和模型。

81、本發(fā)明的一個(gè)基本優(yōu)點(diǎn)是在待觀察的樣品或樣品室中的干預(yù)可以保持非常低。不需要額外的硬件，但是可以使用現(xiàn)有的系統(tǒng)。只有它們的控制和評估才適配于根據(jù)本發(fā)明的方法。

82、本發(fā)明通常在激發(fā)輻射的波長范圍為約440至640nm的情況下進(jìn)行。在進(jìn)一步的配置中，當(dāng)使用多光子激發(fā)時(shí)，例如高達(dá)1600nm的激發(fā)波長是可能的。

83、為了執(zhí)行根據(jù)本發(fā)明的方法，可以使用顯微鏡來確定介質(zhì)流過的樣品室中的流動特性。例如，可以使用適于進(jìn)行基于熒光的方法的顯微鏡，例如熒光相關(guān)光譜(fcs)或frap(光漂白后熒光恢復(fù))顯微鏡。這種顯微鏡可以是例如點(diǎn)掃描或線掃描顯微鏡。

84、在本發(fā)明的另外的實(shí)施例中，可以例如以薄光片的形式進(jìn)行利用激發(fā)輻射的照明。以這種方式，只有在光片中逐層照明的區(qū)域內(nèi)的物體被激發(fā)以發(fā)射熒光輻射(例如：singh,a.p.等人的the?performance?of?2d?array?detectors?for?light?sheet?basedfluorescence?correlation?spectroscopy,optics?express,21(7)(2013)8652-8668)。

85、在有利的實(shí)施例中，顯微鏡在樣品室中具有用于檢測來自樣品室中產(chǎn)生的共焦體積的檢測輻射的物鏡和檢測光束路徑，檢測到的檢測輻射沿著該檢測光束路徑被引導(dǎo)到具有多個(gè)檢測器元件的檢測器陣列，其中檢測器陣列被布置在與物鏡的后側(cè)像平面共軛的平面(像平面；針孔平面)中，并且可以單獨(dú)讀取來自檢測器元件的測量值。該平面特別是中間像平面，其中至少一個(gè)針孔布置在共焦檢測光束路徑中。在根據(jù)本發(fā)明的顯微鏡中，針孔的功能由檢測器的各個(gè)檢測器元件實(shí)現(xiàn)。

86、作為檢測器，可以有利地存在已經(jīng)提到的airyscan檢測器或spad陣列中的一個(gè)。例如，諸如微透鏡陣列的光學(xué)元件可以放置在檢測器元件的前面。具有單獨(dú)可讀檢測器元件的其他二維檢測器也是可能的。

87、根據(jù)本發(fā)明的顯微鏡可以具有變焦光學(xué)單元。后者可以用于檢測輻射的束的范圍的受控修改，例如以使檢測到的檢測輻射的束的范圍適配于空間分辨檢測器的檢測表面(檢測平面)的尺寸。

88、根據(jù)本發(fā)明的顯微鏡還包括分析單元，該分析單元被配置用于執(zhí)行根據(jù)方法權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法。這種分析單元可以是例如計(jì)算機(jī)、微控制器或fpga。

89、此外，可用的是控制單元，該控制單元不僅可以被設(shè)計(jì)用于控制顯微鏡的部件，而且可以被設(shè)計(jì)用于選擇位置和/或所選擇位置的接近。通過將樣品室和/或物鏡放置在顯微鏡的檢測光束路徑的焦點(diǎn)被引導(dǎo)到選定位置的彼此相對位置來接近選定位置。

90、分析單元和控制單元可以是顯微鏡的單獨(dú)部件。在另一個(gè)實(shí)施例中，它們是計(jì)算設(shè)備(例如計(jì)算機(jī)或控制電路)的相應(yīng)配置的隔室。

91、通過根據(jù)當(dāng)前要求適配照明輻射或檢測輻射的光束形狀，可以有利地支持根據(jù)本發(fā)明的方法。為此，例如，可控設(shè)置的可變光闌可以作為光束成形光學(xué)單元布置在顯微鏡的照明光束路徑中或檢測光束路徑中。例如，照明光束路徑的直徑的減小導(dǎo)致物鏡光瞳的輸入側(cè)上的填充不足，并且因此導(dǎo)致共焦體積的增加。

92、在根據(jù)本發(fā)明的顯微鏡的實(shí)施例中，可控設(shè)置的(激光)光束擴(kuò)展器可以被布置為顯微鏡的照明光束路徑中或檢測光束路徑中的光束成形光學(xué)單元。光束擴(kuò)展器通常基于望遠(yuǎn)鏡構(gòu)造。同樣可以通過電動可變光束擴(kuò)展器的設(shè)置的效果來增加或減少共焦體積。

93、在根據(jù)本發(fā)明的顯微鏡的另一實(shí)施例中，狹縫光闌可以被布置為照明光束路徑中或檢測光束路徑中的光束成形光學(xué)單元，其效果是產(chǎn)生橫向于光束路徑伸長的psf。在空間和/或時(shí)間上調(diào)制psf的光學(xué)元件的存在同樣是可能的，例如空間光調(diào)制器(slm)或相應(yīng)地可控制地設(shè)置的相位掩模和/或可以可控制地進(jìn)入和離開光束路徑的相位掩模。

94、可以有利地控制上述光闌或光學(xué)元件，并且可以以有針對性的方式影響其光學(xué)效果。