本發(fā)明涉及生物傳感器設(shè)計設(shè)計領(lǐng)域，尤其涉及一種基于級聯(lián)信號放大策略的長棘海星生物傳感器設(shè)計方法。

背景技術(shù)：

1、作為造礁珊瑚的天敵，長棘海星(crown-of-thorns?starfish,cots)的反復(fù)暴發(fā)已成為印度洋-太平洋地區(qū)珊瑚礁危機(jī)的最重要原因之一。長棘海星的反復(fù)暴發(fā)導(dǎo)致珊瑚大量死亡和珊瑚覆蓋率持續(xù)下降，從而導(dǎo)致海洋生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)性和生物多樣性受到嚴(yán)重影響。調(diào)查顯示，1985年至2012年間，澳大利亞大堡礁的活珊瑚覆蓋率下降了50.7％，其中42％的珊瑚死于長棘海星暴發(fā)，并且目前正在經(jīng)歷第四次嚴(yán)重的長棘海星暴發(fā)。此外，在中國南海的一些海域，由于長棘海星暴發(fā)導(dǎo)致珊瑚死亡率高達(dá)95％。然而，由于長棘海星的幼體和成體能見度低、行為隱蔽，依靠蝠鲼拖網(wǎng)等常規(guī)生態(tài)調(diào)查方法只能發(fā)現(xiàn)5-10％的長棘海星，無法準(zhǔn)確追蹤災(zāi)害暴發(fā)的早期階段，從而阻礙了及時干預(yù)。因此，仍然急需服務(wù)于長棘海星暴發(fā)的可靠和準(zhǔn)確的早期預(yù)警技術(shù)。

2、目前，環(huán)境dna(edna)分子檢測技術(shù)因其非侵入性、高效性和準(zhǔn)確性而在生物監(jiān)測中顯示出巨大的潛力。據(jù)此，uthicke和kwong等人利用edna技術(shù)，通過數(shù)字液滴pcr(ddpcr)實(shí)現(xiàn)了對低密度長棘海星群體的檢測，并量化了edna的脫落率和降解率，為長棘海星暴發(fā)的早期預(yù)警提供了支持。然而，由于edna易受各種外在因素的影響，且難以長期儲存和運(yùn)輸，而上述方法也需要大型儀器和訓(xùn)練有素的人員。因此，針對長棘海星edna的檢測，開發(fā)一種現(xiàn)場、低成本且快速的方法對于提高監(jiān)測效率和精度尤為重要。

3、近年來，電化學(xué)生物傳感器因其便攜性、簡易性、經(jīng)濟(jì)性和高靈敏度而成為一種有吸引力的分子檢測手段。這些生物傳感器的工作原理是將目標(biāo)分子與固定在電極表面的探針的雜交事件轉(zhuǎn)化為可量化的信號(如阻抗、電位或電流)，并通過電化學(xué)方法進(jìn)行記錄。值得注意的是，wang等人首次利用電化學(xué)生物傳感器實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測長棘海星環(huán)境dna(edna)，為在暴發(fā)早期階段監(jiān)測長棘海星提供了新方法。然而，海洋的稀釋效應(yīng)導(dǎo)致海洋中的edna濃度水平相當(dāng)?shù)汀Ｒ虼?，更高的靈敏度和更低的檢測限仍然是長棘海星災(zāi)害精確預(yù)警的巨大挑戰(zhàn)。

4、為了解決上述問題，需要信號放大策略來滿足高靈敏度和低檢測限的需求。目前，無酶dna自組裝擴(kuò)增策略，包括催化發(fā)夾組裝(catalytic?hairpin?assembly，cha)或雜交鏈反應(yīng)(hybridization?chain?reaction，hcr)，被廣泛用于生物傳感器的構(gòu)建。cha是在特定目標(biāo)催化下啟動發(fā)夾探針的組裝，產(chǎn)生一系列雙鏈dna(dsdna)，背景低且目標(biāo)實(shí)現(xiàn)循環(huán)放大。hcr是通過目標(biāo)識別引發(fā)兩個發(fā)夾dna發(fā)生程序化交替雜交，生成長的dsdna，可以提供指數(shù)擴(kuò)增效果，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)的放大。然而，單一的擴(kuò)增策略(cha或hcr)的效率仍然有限。因此，上述擴(kuò)增技術(shù)的組合有利于提供更精確的分析性能。

5、電化學(xué)生物傳感器具有便攜、操作簡單、經(jīng)濟(jì)和高靈敏度等特點(diǎn)，在dna檢測領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。wang等人構(gòu)建了單探針策略的電化學(xué)生物傳感器，并首次利用到現(xiàn)場快速檢測長棘海星環(huán)境dna(edna)，為在暴發(fā)早期階段監(jiān)測長棘海星提供了新方法。然而，由于海洋的稀釋效應(yīng)，使得海洋中的edna濃度水平相當(dāng)?shù)??；趩翁结槻呗缘碾娀瘜W(xué)生物傳感器存在容易受到強(qiáng)烈的背景信號的影響，容易出現(xiàn)假陽性。同時，單探針策略的工作原理是直接與目標(biāo)dna雜交，沒有經(jīng)過信號放大過程，因此無法實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場痕量檢測的需求。因此，更高的靈敏度和更低的檢測限仍然是長棘海星災(zāi)害的精確預(yù)警的巨大挑戰(zhàn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種基于級聯(lián)信號放大策略的長棘海星生物傳感器設(shè)計方法，解決背景技術(shù)提到的技術(shù)問題。

2、解決了傳統(tǒng)單探針策略靈敏度低、特異性差，難以滿足現(xiàn)場痕量檢測長棘海星edna的問題。本發(fā)明開發(fā)了一種新型電化學(xué)生物傳感器，采用級聯(lián)放大策略以提高檢測靈敏度。該電化學(xué)生物傳感器結(jié)合了催化發(fā)夾組裝(cha)和雜交鏈反應(yīng)(hcr)策略，實(shí)現(xiàn)了無需依賴蛋白酶標(biāo)記的信號放大，滿足痕量檢測要求。在中國南海的現(xiàn)場檢測中，該電化學(xué)生物傳感器的適用性再次得到驗(yàn)證。此外，通過與ddpcr比較，進(jìn)一步驗(yàn)證了該生物傳感器的可靠性和準(zhǔn)確性。

3、為了解決傳統(tǒng)單探針策略靈敏度低、特異性差，難以滿足現(xiàn)場痕量檢測的問題，成功構(gòu)建了一種新型電化學(xué)生物傳感器，采用級聯(lián)放大策略以提高檢測靈敏度。該電化學(xué)生物傳感器結(jié)合了催化發(fā)夾組裝(cha)和雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(hcr)策略，實(shí)現(xiàn)了無需依賴蛋白酶標(biāo)記的信號放大，實(shí)現(xiàn)了現(xiàn)場痕量水平長棘海星edna示蹤。因此，本發(fā)明開發(fā)的基于級聯(lián)放大策略的電化學(xué)生物傳感器靈敏度高、適用性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高，為現(xiàn)場長棘海星edna檢測和長棘海星暴發(fā)預(yù)警提供了有力的工具。

4、將cha和hcr放大結(jié)合在一起，用于超靈敏檢測長棘海星edna。該生物傳感器由于cha與hcr的結(jié)合，無需蛋白酶和標(biāo)記即可實(shí)現(xiàn)信號放大，解決傳統(tǒng)單探針策略靈敏度低、特異性差等問題。此外，還利用便攜式生物傳感器在中國南海的幾個典型疫點(diǎn)現(xiàn)場檢測了長棘海星edna。因此，本發(fā)明為長棘海星暴發(fā)現(xiàn)場預(yù)警提供了新見解和獨(dú)特的技術(shù)支持。

5、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

6、一種基于級聯(lián)信號放大策略的長棘海星生物傳感器設(shè)計方法，所述方法包括如下步驟：

7、步驟1：設(shè)計dna探針；

8、步驟2：電化學(xué)生物傳感器的構(gòu)建；

9、步驟3：對構(gòu)建好的電化學(xué)生物傳感器電化學(xué)測試；

10、步驟4：電化學(xué)生物傳感器的構(gòu)建和可行性分析；

11、步驟5：對電化學(xué)生物傳感器性能評價，完成電化學(xué)生物傳感器設(shè)計。

12、進(jìn)一步地，步驟1中，dna探針的捕獲探針的序列為：tgg?ttc?tgt?tta?tag?tggatt?tt(c6)-sh，發(fā)夾探針1的序列為：tat?aaa?cag?aac?cac?gct?aga?taa?tgg?agg?gtagac?caa?cca?cct?cta?ccc?tcc?att?at，發(fā)夾探針2的序列為：ctt?ggg?ttt?cat?gtg?tgtaga?ggt?ggt?tgg?tct?acc?ctc?cat?tcc?aac?cac?c，發(fā)夾探針3的序列為：aca?cat?gaaacc?caagtg?ctg?act?tgg?gtt?tc，發(fā)夾探針4的序列為：ctt?ggg?ttt?cat?gtg?tga?aaccca?agt?cag?ca，靶dna的序列為：tct?acc?ctc?cat?tat?cta?gcg；

13、所有發(fā)夾探針在使用前均在95℃退火10分鐘，然后以1℃/min的速度冷卻至室溫，以確保能夠形成穩(wěn)定的發(fā)夾，所有的探針在使用前保存在4℃下。

14、進(jìn)一步地，步驟2的具體過程為：

15、利用0.30和0.05微米的氧化鋁粉對金電極aue進(jìn)行打磨，隨后，采用乙醇和超純水交替超聲30秒，以去除電極表面殘留的氧化鋁，接下來，在0.5mh2so4中對aue進(jìn)行電化學(xué)清洗和活化，最后，使用超純水清洗電極，并在氮?dú)饬髦羞M(jìn)行電極干燥，最終獲得表面干凈的裸金電極；

16、捕獲探針cp在使用前，需要加入10mm?tcep處理1小時以還原二硫鍵，然后，將10μlcp滴在aue表面，并在4℃孵育過夜，最后，用1mm?mch在室溫避光的條件下，處理電極表面30分鐘，以阻斷表面非特異性結(jié)合位點(diǎn)，最終，將構(gòu)建好的電極在使用前，放置在4℃保存，每次修飾后都要用洗滌緩沖液沖洗電極。

17、進(jìn)一步地，步驟3中，將不同濃度的目標(biāo)dna與發(fā)夾探針1和發(fā)夾探針2在37℃下孵育2小時，以進(jìn)行cha放大反應(yīng)，隨后，將cha產(chǎn)物滴加到預(yù)先制備好的aue表面，并與固定在aue上的cp進(jìn)行雜交，雜交時間為0.5小時，接下來，將15μl的發(fā)夾探針3和發(fā)夾探針4的混合物滴在電極表面上，在37℃下孵育1.5小時，進(jìn)行hcr擴(kuò)增反應(yīng)，最后，在電極表面滴入10μl亞甲基藍(lán)，并在室溫下孵育15分鐘，使mb嵌入電極表面的雙鏈dna，完成以上步驟后，將電極與工作站連接，對目標(biāo)dna進(jìn)行電化學(xué)測試，每次改性后都要用洗滌緩沖液沖洗電極；

18、使用三電極體系進(jìn)行電化學(xué)測量，dpv是將電極浸入工作緩沖液中進(jìn)行，脈沖寬度為0.05s，脈沖周期為0.2s，脈沖幅度為50mv，電位掃描范圍為-0.5v至0.1v；循環(huán)伏安法(cv)參數(shù)設(shè)置為電位范圍為-0.2至0.6v，掃描速率為0.1v/s；電化學(xué)阻抗譜(eis)測試的頻率范圍為10khz至0.1hz，庫倫曲線測試參數(shù)分別設(shè)置為電位范圍為0.5至-0.2v，脈沖寬度為0.25s，采樣間隔為2ms，便攜式電化學(xué)生物傳感器是利用集成式芯片電極進(jìn)行，dpv測試參數(shù)分別設(shè)置為掃描電壓為-0.55至-0.15v，脈沖電壓為0.05v，脈沖寬度為0.05s，脈沖周期為0.5s。

19、進(jìn)一步地，步驟4中，通過電化學(xué)阻抗譜對電化學(xué)生物傳感器的逐步組裝步驟進(jìn)行表征，所有電極的eis曲線都由高頻弧線和低頻線性組成，其中高頻弧線區(qū)域的半圓直徑?jīng)Q定電極界面處的電子轉(zhuǎn)移動力學(xué)，通過randles等效電路用于擬合eis數(shù)據(jù)，其中rs代表溶液電阻，rct代表電荷轉(zhuǎn)移電阻，zw代表沃伯格擴(kuò)散元件，cdl代表電極與電解質(zhì)溶液之間的雙層電容，aue的阻抗曲線近似直線，經(jīng)過擬合后的rct僅為15ω，隨后，捕獲探針通過au-s鍵錨定到aue表面，帶負(fù)電荷的dna磷酸骨架與[fe(cn)6]3-/4-分子之間的排斥力使得rct增加，在電極上固定mch后，rct增加，在目標(biāo)dna存在的情況下，通過cha反應(yīng)生成的發(fā)夾探針1/發(fā)夾探針1復(fù)合物會被電極表面的cp捕獲，在電極表面形成較長的dsdna鏈，使得dna磷酸骨架與[fe(cn)6]3-/4-分子之間的排斥力增強(qiáng)，從而提高rct，通過添加發(fā)夾探針3和發(fā)夾探針4，hcr在電極表面進(jìn)行，引入帶負(fù)電荷的dna鏈，使得電極表面與[fe(cn)6]3-/4-分子之間的排斥力增強(qiáng)，提高rct，結(jié)果證明長棘海星dna生物傳感器的成功構(gòu)建；

20、為了評估所構(gòu)建的電化學(xué)生物傳感器用于長棘海星edna檢測的可行性，進(jìn)行差分脈沖伏安法測試，在沒有目標(biāo)dna的情況下，僅發(fā)夾探針1可以與cp雜交，從而錨定在電極表面，產(chǎn)生比設(shè)定值低的背景信號，相反，在有目標(biāo)dna的情況下，會觸發(fā)cha反應(yīng)，形成穩(wěn)定的發(fā)夾探針1/發(fā)夾探針2復(fù)合物，電流信號增加，接下來，當(dāng)電極與發(fā)夾探針3和發(fā)夾探針4一起孵育時，會觸發(fā)hcr反應(yīng)，在電極表面生成dsdna，電流信號增加，在目標(biāo)dna存在的情況下，cha和hcr成功地進(jìn)行，產(chǎn)生了更長的dsdna分子和更多的mb積累，獲得更高的電流信號。

21、進(jìn)一步地，步驟5中，在實(shí)驗(yàn)條件為cp濃度1.25μm，mb孵育時間為15min，cha反應(yīng)時間為120min，hcr反應(yīng)時間為90min中，利用dpv評估所構(gòu)建的基于程序化cha/hcr循環(huán)放大策略的電化學(xué)生物傳感器的分析性能，隨著目標(biāo)dna濃度從50fm增加到10nm，電流信號逐漸增加，與目標(biāo)dna濃度的增加促進(jìn)產(chǎn)生更多的dsdna并進(jìn)一步嵌入更多的mb以顯示電信號的事實(shí)一致。根據(jù)公式(1)，電流信號與目標(biāo)dna濃度的對數(shù)之間存在線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.982：

22、i＝1.799lgc+28.983?????(1)

23、根據(jù)空白檢測的3倍sd為基準(zhǔn)計算所構(gòu)建的電化學(xué)生物傳感器的檢測限lod為18.4fm，構(gòu)建的基于程序化cha/hcr循環(huán)放大策略的電化學(xué)生物傳感器的lod比現(xiàn)有基于單探針策略的電化學(xué)生物傳感器的lod低106倍，根據(jù)與空白測試相對應(yīng)的10倍sd，所構(gòu)建的電化學(xué)生物傳感器的定量限loq為41.1fm，實(shí)現(xiàn)長棘海星edna的超靈敏檢測。

24、本發(fā)明由于采用了上述技術(shù)方案，具有以下有益效果：

25、(1)本發(fā)明解決了傳統(tǒng)單探針策略靈敏度低、特異性差，難以滿足現(xiàn)場痕量檢測長棘海星edna的問題，開發(fā)了一種新型電化學(xué)生物傳感器，采用級聯(lián)放大策略以提高檢測靈敏度，該電化學(xué)生物傳感器結(jié)合了催化發(fā)夾組裝(cha)和雜交鏈反應(yīng)(hcr)策略，實(shí)現(xiàn)了無需依賴蛋白酶標(biāo)記的信號放大，滿足痕量檢測要求。在中國南海的現(xiàn)場檢測中，該電化學(xué)生物傳感器的適用性再次得到驗(yàn)證，此外，通過與ddpcr比較，進(jìn)一步驗(yàn)證了該生物傳感器的可靠性和準(zhǔn)確性。

26、(2)通過級聯(lián)放大策略，即催化發(fā)夾組裝(cha)和雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(hcr)結(jié)合的策略，成功構(gòu)建了一種新型電化學(xué)生物傳感器，用于長棘海星edna的檢測。通過該策略構(gòu)建的傳感器無需依賴蛋白酶和標(biāo)記即可實(shí)現(xiàn)信號放大，實(shí)現(xiàn)了現(xiàn)場痕量水平長棘海星edna示蹤。