本發(fā)明屬于生物技術(shù)檢測領(lǐng)域，具體涉及一種雙氯芬酸酶聯(lián)免疫試劑盒及在檢測動(dòng)物組織中雙氯芬酸藥物殘留的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、雙氯芬酸，屬于非甾體抗炎藥，具有抗炎、鎮(zhèn)痛及解熱作用，可用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、癌癥、創(chuàng)傷后疼痛及各種炎癥所致發(fā)熱。在獸醫(yī)臨床上主要藥用形式是雙氯芬酸鈉，用于中小動(dòng)物的鎮(zhèn)痛解熱，對(duì)禽類有毒害作用。雙氯芬酸鈉在動(dòng)物體內(nèi)殘留標(biāo)志物為雙氯芬酸。

2、國內(nèi)雙氯芬酸鈉被批準(zhǔn)為新獸藥，用于豬外傷手術(shù)、炎癥等引起的疼痛和發(fā)熱，同時(shí)也有用于牛治療的試驗(yàn)報(bào)道。中國及歐盟均規(guī)定，在牛和豬的肌肉、肝臟、腎臟中的最大殘留限量分別為5、5、10μg/kg。人們食用含有雙氯芬酸的動(dòng)物組織后，會(huì)有害于人類健康。

3、目前，雙氯芬酸的檢測方法主要為儀器檢測方法，有高效液相色譜法，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等。儀器分析法雖然具有檢測準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，但是存在前處理程序繁瑣，測定時(shí)間長，儀器成本高，對(duì)檢測人員專業(yè)度要求高等缺點(diǎn)，不利于大批量樣品的篩查工作，也不利于對(duì)雙氯芬酸藥物使用進(jìn)行有效監(jiān)管。酶聯(lián)免疫吸附法是基于抗原與抗體之間的特異性結(jié)合反應(yīng)發(fā)展起來的，以酶為反應(yīng)介質(zhì)的快速篩選方法，具有檢測簡便、快速，檢測樣品量大，對(duì)檢測人員要求不高等特點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種檢測穩(wěn)定性強(qiáng)，檢測靈敏度高，特異性強(qiáng)，檢測所需時(shí)間短的雙氯芬酸酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。

2、本發(fā)明技術(shù)方案：

3、一種雙氯芬酸酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，包括包被有雙氯芬酸半抗原-血藍(lán)蛋白偶聯(lián)物的微孔酶標(biāo)板、雙氯芬酸抗體工作液、雙氯芬酸標(biāo)準(zhǔn)品、辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗抗體工作液、20×濃縮洗滌液、底物液a、底物液b、終止液，所述微孔酶標(biāo)板上包被了雙氯芬酸半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物，所述雙氯芬酸抗體工作液中加入含2％甘油、2.5％海藻糖、2.5％蛋白胨、1％山梨醇、0.01％proclin300，0.01mol/lph7.4的pbs緩沖液作為抗體穩(wěn)定劑，所述辣根過氧化物酶標(biāo)記抗抗體工作液中加入了含6％明膠、0.05％山梨酸鉀、1.5％牛血清白蛋白、0.5％吐溫80?的50mmol/ltris緩沖液作為酶結(jié)合物穩(wěn)定劑。

4、進(jìn)一步地，雙氯芬酸半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物由以下步驟制備得到：稱取雙氯芬酸鈉10mg溶解于0.5ml?dmf中，得到半抗原稀釋液；稱取10mg?edc和10mg?nhs溶解于0.2ml去離子水后，將其加入半抗原稀釋液中，室溫?cái)嚢?.5h，得到活化半抗原稀釋液；稱取載體蛋白牛血清白蛋白或血藍(lán)蛋白40mg，使其充分溶解于4ml?0.01mol/lpbs中；向溶解后的載體蛋白溶液中加入活化半抗原稀釋液，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)16h；用0.01mol/lpbs透析制備得到雙氯芬酸半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物。

5、其中，雙氯芬酸抗體由雙氯芬酸半抗原-牛血清白蛋白偶聯(lián)物作為免疫原免疫小鼠或兔子制備得到。

6、進(jìn)一步地，濃縮洗滌液成分為含1％吐溫-20，0.1mol/lpbs緩沖液。

7、進(jìn)一步地，所述底物a液為過氧化氫，底物b液為tmb，在使用前10min內(nèi)混勻。

8、進(jìn)一步地，終止液為1mol/lh2so4。

9、雙氯芬酸酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，在檢測具體樣品的時(shí)候，還可以包括樣本復(fù)溶液，樣本復(fù)溶液為0.05mol/l檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，ph6.0。

10、本發(fā)明的另一個(gè)目的還提供了上述雙氯芬酸酶聯(lián)免疫檢測試劑盒在檢測豬肉樣本中雙氯芬酸的應(yīng)用。

11、本發(fā)明有益效果：

12、本發(fā)明雙氯芬酸酶聯(lián)免疫檢測試劑盒將偶聯(lián)抗原包被于微孔板，用抗體工作液與樣品反應(yīng)競爭包被物，隨后加入酶標(biāo)二抗檢測并通過底物顯色，進(jìn)行分析測定雙氯芬酸殘留量，建立了間接競爭elisa方法。本發(fā)明在制備雙氯芬酸酶聯(lián)免疫檢測試劑盒時(shí)，在制備酶標(biāo)板過程中用穩(wěn)定劑緩沖液進(jìn)行封閉，在抗體工作液中加入抗體穩(wěn)定劑，在辣根過氧化物酶標(biāo)的抗抗體中加入了辣根過氧化物酶結(jié)合物穩(wěn)定劑，有效提高了本發(fā)明檢測試劑盒的穩(wěn)定性，大大延長了試劑盒的保存時(shí)間，避免了因試劑不穩(wěn)定造成檢測結(jié)果不準(zhǔn)確，且造成浪費(fèi)試劑的現(xiàn)象。本發(fā)明雙氯芬酸酶聯(lián)免疫檢測試劑盒對(duì)雙氯芬酸的檢測靈敏度高達(dá)0.05μg/kg，測定回收率在80-106％之間，板內(nèi)變異系數(shù)在6.2-7.4％之間，板間變異系數(shù)為7.6％。本發(fā)明試劑盒結(jié)構(gòu)簡單，檢測靈敏度高，穩(wěn)定性高，準(zhǔn)確度、精密度檢測數(shù)據(jù)均較好，且檢測成本低，適用于大批量樣品中雙氯芬酸的快速篩查。

技術(shù)特征：

1.一種雙氯芬酸酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，包括微孔酶標(biāo)板、雙氯芬酸抗體工作液、雙氯芬酸標(biāo)準(zhǔn)品、辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗抗體工作液、20×濃縮洗滌液、底物液a、底物液b、終止液；所述微孔酶標(biāo)板上包被了雙氯芬酸半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物；所述雙氯芬酸抗體工作液中加入含2％甘油、2.5％海藻糖、2.5％蛋白胨、1％山梨醇、0.01％proclin300，0.01mol/lph7.4的pbs緩沖液作為抗體穩(wěn)定劑；所述辣根過氧化物酶標(biāo)記抗抗體工作液中加入了含6％明膠、0.05％山梨酸鉀、1.5％牛血清白蛋白、0.5％吐溫80的50mmol/ltris緩沖液作為酶結(jié)合物穩(wěn)定劑。

2.如權(quán)利要求1所述的雙氯芬酸酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述雙氯芬酸半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物由以下步驟制備得到：

3.如權(quán)利要求1或2所述的雙氯芬酸酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述濃縮洗滌液為含1％吐溫-20，0.1mol/lpbs緩沖液，ph?7.2。

4.如權(quán)利要求1或2所述的雙氯芬酸酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述底物a液a為過氧化氫，底物b液為tmb。

5.如權(quán)利要求1或2所述的雙氯芬酸酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述終止液為1mol/lh2so4。

6.如權(quán)利要求1或2所述的雙氯芬酸酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包括樣本復(fù)溶液，所述樣本復(fù)溶液為0.05mol/l檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，ph6.0。

7.如權(quán)利要求1或2所述的雙氯芬酸酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于：所述雙氯芬酸抗體是由雙氯芬酸半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物作為免疫原制備得到的。

8.如權(quán)利要求1或2所述的雙氯芬酸酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于：所述微孔酶標(biāo)板在包被雙氯芬酸半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物過程中加入了含3％蔗糖、0.5％牛血清白蛋白，0.1mol/lph7.2的pbs緩沖液進(jìn)行封閉。

9.如權(quán)利要求1～8任一項(xiàng)所述的雙氯芬酸酶聯(lián)免疫檢測試劑盒在檢測動(dòng)物組織中雙氯芬酸藥物殘留的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種雙氯芬酸酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，包酶標(biāo)微孔板、雙氯芬酸抗體工作液、雙氯芬酸標(biāo)準(zhǔn)品、辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗抗體工作液、20×濃縮洗滌液、底物液A、底物液B、終止液；所述酶標(biāo)微孔板包被了雙氯芬酸半抗原?載體蛋白偶聯(lián)物；所述雙氯芬酸抗體工作液中加入了含2％甘油、2.5％海藻糖、2.5％蛋白胨、1％山梨醇、0.01％Proclin300，0.01mol/LpH7.4的PBS緩沖液作為抗體穩(wěn)定劑；所述辣根過氧化物酶標(biāo)記抗抗體工作液中加入了含6％明膠、0.05％山梨酸鉀、1.5％牛血清白蛋白、0.5％吐溫80的50mmol/LTris緩沖液作為酶結(jié)合物穩(wěn)定劑。本發(fā)明雙氯芬酸酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，檢測靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度參數(shù)均較好，且試劑盒穩(wěn)定性性能指標(biāo)優(yōu)越，能長時(shí)間存儲(chǔ)，是理想的雙氯芬酸檢測產(chǎn)品。

技術(shù)研發(fā)人員：王世恩,楊昌松,郝士元
受保護(hù)的技術(shù)使用者：松元恩河北生物科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/2