本發(fā)明屬于電化學(xué)，涉及免疫傳感器，具體涉及一種基于氨基功能化cofs的無(wú)標(biāo)記tau蛋白電化學(xué)免疫傳感器、制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、在阿爾茨海默癥(ad)的特征性病理表現(xiàn)為大腦中的神經(jīng)細(xì)胞逐漸死亡，并伴有兩種異常蛋白質(zhì)的沉積：淀粉樣蛋白和神經(jīng)元纖維纏結(jié)。

2、tau蛋白作為一種微管相關(guān)蛋白，正常情況下參與神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)微管的穩(wěn)定和組裝。患有ad時(shí)，tau蛋白異常磷酸化，使其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，無(wú)法正確與微管結(jié)合。異常磷酸化的tau蛋白開始聚集，形成不溶性的神經(jīng)元纖維纏結(jié)。這些纏結(jié)狀結(jié)構(gòu)不僅影響神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)微管的組裝和穩(wěn)定，還干擾了神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的其他生物過程，如物質(zhì)運(yùn)輸和信號(hào)傳導(dǎo)。因此，基于ad患者腦脊液中tau蛋白的異常水平，使tau蛋白可作為ad疾病的重要生物標(biāo)志物。

3、然而，現(xiàn)有技術(shù)中tau蛋白電化學(xué)免疫傳感器構(gòu)建層數(shù)多，導(dǎo)致制作成本高、穩(wěn)定性不佳，而且檢出限不夠低，因此需要進(jìn)一步修飾以得到一種能夠穩(wěn)定連接tau蛋白且檢出限較低的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的在于，提供一種基于氨基功能化cofs的無(wú)標(biāo)記tau蛋白電化學(xué)免疫傳感器、制備方法及應(yīng)用，以解決現(xiàn)有技術(shù)中tao蛋白電化學(xué)免疫傳感器的穩(wěn)定性及檢出限度有待進(jìn)一步降低的技術(shù)問題。

2、本發(fā)明的另一個(gè)目的在于，提供一種基于氨基功能化cofs的無(wú)標(biāo)記tau蛋白電化學(xué)免疫傳感器、制備方法及應(yīng)用，以解決現(xiàn)有技術(shù)中tao蛋白電化學(xué)免疫傳感器的穩(wěn)定性有待進(jìn)一步提升的技術(shù)問題。

3、為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：

4、一種電化學(xué)免疫傳感器的制備方法，該方法按照以下步驟進(jìn)行：

5、首先，2-硝基-1,4-苯二胺、1,3,5-三醛基間苯三酚和羧基化碳納米管為原料，采用水熱法合成tppa-no2@cnt。

6、其次，將tppa-no2@cnt還原得到tppa-nh2@cnt。

7、然后，將tppa-nh2@cnt懸浮于含離子液體(il)的磷酸鹽緩沖溶液(pbs)中，再滴涂于碳糊電極表面形成tppa-nh2@cnt/il層，制得

8、tppa-nh2@cnt/il/cpe。

9、最后，tppa-nh2@cnt/il/cpe干燥后再依次用tau蛋白抗體和牛血清蛋白修飾，制得電化學(xué)免疫傳感器bsa/anti-tau/tppa-nh2@cnt/il/cpe。

10、本發(fā)明還具有如下技術(shù)特征：

11、具體的，該方法具體按照以下步驟進(jìn)行：

12、步驟一，將2-硝基-1,4-苯二胺、1,3,5-三醛基間苯三酚和羧基化碳納米管(cnt)加入至均三甲苯中、1,4-二氧六環(huán)和乙酸三者的混合液中，進(jìn)行水熱反應(yīng)，然后離心并真空干燥，得到tppa-no2@cnt。

13、步驟二，將步驟一得到的tppa-no2@cnt加入至溶有無(wú)水氯化亞錫的四氫呋喃溶液中，攪拌3h后離心、收集沉淀，并將該沉淀物在鹽酸中懸浮，然后離心并真空干燥，得到tppa-nh2@cnt。

14、步驟三，將步驟二得到的tppa-nh2@cnt分散于含離子液體(il)的磷酸鹽緩沖溶液(pbs)中，形成混合物懸浮液，并移取混合物懸浮液滴涂在碳糊電極(cpe)表面形成tppa-nh2@cnt/il層，置于室溫晾干，制得tppa-nh2@cnt/il/cpe。

15、步驟四，在步驟三得到的tppa-nh2@cnt/il/cpe上滴涂tau蛋白抗體(anti-tau)并置于冰箱晾干，得到修飾電極anti-tau/tppa-nh2@cnt/il/cpe。

16、步驟五，繼續(xù)在步驟四所得修飾電極anti-tau/tppa-nh2@cnt/il/cp的表面滴涂1wt.％牛血清蛋白(bsa)溶液，置于冰箱干燥，制得修飾電極bsa/anti-tau/tppa-nh2@cnt/il/cpe，即為電化學(xué)免疫傳感器。

17、優(yōu)選的，步驟三，將1.0mg～5.0mg的tppa-nh2@cnt粉末超聲分散于含有15μl離子液體的1ml?0.01mol/l?pbs溶液中，形成混合物懸浮液，并移取10μl滴涂在碳糊電極表面，置于室溫晾干，制得tppa-nh2@cnt/il/cpe。

18、優(yōu)選的，步驟四，在tppa-nh2@cnt/il復(fù)合膜修飾的碳糊電極上滴涂5μl濃度為5μg/ml～40μg/ml的tau蛋白抗體并置于冰箱于4℃晾干，得到修飾電極anti-tau/tppa-nh2@cnt/il/cpe。

19、優(yōu)選的，步驟一中，所述的2-硝基-1,4-苯二胺、1,3,5-三醛基間苯三酚和羧基化碳納米管的摩爾比為1.5∶1∶1。

20、優(yōu)選的，步驟一中，均三甲苯、1,4-二氧六環(huán)和乙酸三者的體積比為3∶3∶1。

21、優(yōu)選的，步驟二中，無(wú)水氯化亞錫的四氫呋喃溶液的濃度為0.5mg/ml。

22、優(yōu)選的，步驟二中，將該沉淀物在6ml濃度為2mol/l的鹽酸中懸浮5h，

23、優(yōu)選的，步驟三中，每1ml的磷酸鹽緩沖溶液中加入15μl離子液體。

24、優(yōu)選的，步驟三中，所述的離子液體為1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽。

25、優(yōu)選的，步驟三中，所述的碳糊電極在使用前需要將碳糊電極在稱量紙上打磨成鏡面，之后置于所述的磷酸鹽緩沖溶液中，采用循環(huán)伏安法掃描10個(gè)周期，進(jìn)行電化學(xué)活化處理。

26、優(yōu)選的，步驟三中，所述的混合物懸浮液的滴涂量為10μl。

27、優(yōu)選的，步驟四中，所述的tau蛋白抗體的滴涂量為5μl。

28、優(yōu)選的，步驟五中，所述的1wt.％牛血清蛋白溶液的滴涂量為5μl。

29、本發(fā)明保護(hù)一種電化學(xué)免疫傳感器，所述的電化學(xué)免疫傳感器該采用如上所述的電化學(xué)免疫傳感器的制備方法制得。

30、本發(fā)明還保護(hù)如上所述的電化學(xué)免疫傳感器用于檢測(cè)tau蛋白的應(yīng)用。

31、具體的，所述的電化學(xué)免疫傳感器bsa/anti-tau/tppa-nh2@cnt/il/cpe浸沒在濃度為10-3～104ng/ml的tau蛋白(tau)中，于27℃～47℃水浴鍋中孵育10min～50min。

32、優(yōu)選的，所述的電化學(xué)免疫傳感器bsa/anti-tau/tppa-nh2@cnt/il/cpe浸沒在濃度為10-3～104ng/ml的tau蛋白中，于37℃水浴鍋中孵育40min。

33、本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下技術(shù)效果：

34、(ⅰ)本發(fā)明的電化學(xué)免疫傳感器能以較寬的線性范圍(10-3～104ng/ml)和較低的檢出限(0.33pg/ml，s/n＝3)檢測(cè)tau蛋白。這個(gè)檢測(cè)范圍涵蓋了ad患者腦脊液內(nèi)tau蛋白的濃度，說明該電化學(xué)免疫傳感器的性能已經(jīng)達(dá)到了實(shí)際使用的標(biāo)準(zhǔn)。

35、(ⅱ)本發(fā)明的cofs為tppa-nh2，tppa-nh2是一種特殊的亞胺類cofs，在有機(jī)構(gòu)筑單元形成cofs以后，配體1,3,5-三醛基間苯三酚處會(huì)發(fā)生烯醇-酮互變異構(gòu)，像一把“鎖”將cofs六元環(huán)結(jié)構(gòu)固定，從而使cofs擁有卓越的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性，在強(qiáng)酸堿、強(qiáng)氧化還原的氛圍中依然可以保持原有結(jié)構(gòu)，這就為tppa合成后的功能化提供了基礎(chǔ)。

36、(ⅲ)本發(fā)明把氨基功能化的cofs材料引入到電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)筑當(dāng)中，使cofs骨架上的氨基通過多種作用力將抗體anti-tau固定在材料表面。cofs材料固有的孔道結(jié)構(gòu)的較大的比表面積為抗體的固定提供豐富的空間條件，而廣泛分布于cofs骨架上氨基結(jié)構(gòu)又能為anti-tau的固定提供豐富的活性位點(diǎn)。tppa-nh2@cnt將anti-tau大量地、直接地固定在修飾電極的表面，使電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)建周期明顯縮短。

37、(ⅳ)本發(fā)明的電化學(xué)免疫傳感器具有重現(xiàn)性高、選擇性較強(qiáng)的特點(diǎn)，進(jìn)一步展現(xiàn)了本發(fā)明構(gòu)建的電化學(xué)免疫傳感器的實(shí)用價(jià)值。