本發(fā)明涉及藥物分析，具體為一種甲基苯丙胺和苯丙胺對(duì)映異構(gòu)體的手性衍生檢測方法。

背景技術(shù)：

1、甲基苯丙胺(methamphetamine，mamp)，又名甲基安非他明，是一種苯丙胺類化學(xué)物質(zhì)，是我國規(guī)定管制的精神活性物質(zhì)，也是世界反興奮劑機(jī)構(gòu)發(fā)布的禁用列表中的s6類興奮劑。甲基苯丙胺作為精神活性類毒品，嚴(yán)重影響著人體健康與公共安全。同時(shí)，甲基苯丙胺作為運(yùn)動(dòng)員禁用的興奮劑藥物，違規(guī)使用也影響著運(yùn)動(dòng)員的健康和體育的公平公正，因此，建立人體樣本中mamp及其代謝物的高靈敏度檢測方法十分必要。

2、mamp的化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有1個(gè)手性碳原子，因此存在1對(duì)對(duì)映異構(gòu)體，即s-(+)-甲基苯丙胺和r-(-)-甲基苯丙胺。s-(+)-mamp是目前成癮性毒品“冰毒”的主要成分，在本世紀(jì)初期我國警方查貨的mamp主要為s型，但隨著打擊力度持續(xù)加大，r型mamp逐漸出現(xiàn)且占比迅速上升。苯丙胺(amp)作為甲基苯丙胺的主要代謝物，也存在r型和s型。r型和s型甲基苯丙胺物理化學(xué)性質(zhì)相近，但藥理、毒理作用差異巨大。因此，建立mamp及其代謝物amp的手性拆分檢測方法顯得極為重要。當(dāng)作為興奮劑時(shí)，根據(jù)興奮劑禁用列表中的描述，s型mamp屬于s6a類非特定刺激劑，而r型mamp屬于s6b類特定刺激劑，當(dāng)存在違規(guī)使用該類興奮劑的情況時(shí)，二者的處罰力度存在顯著差異。因此，從興奮劑篩查工作的角度，也亟需建立人體樣本中mamp及其代謝物的手性拆分和定性檢測方法。

3、近年來，研究人員多采用手性固定相裝填的色譜柱進(jìn)行mamp及其類似物和代謝物的手性拆分。如中國專利(公開號(hào)為cn?108181385?a)公開了一種同時(shí)檢測液態(tài)生物檢材中甲基苯丙胺和苯丙胺的對(duì)映異構(gòu)體的方法，該方法利用對(duì)映體與手性色譜柱之間的立體作用差異進(jìn)行拆分，樣品處理簡單。缺點(diǎn)是該方法的手性識(shí)別能力較專一，同一色譜柱分析的樣品類型較為局限，通用性不大，且較為昂貴。而基于手性衍生的技術(shù)憑借其良好的分離能力和常規(guī)色譜條件的良好的兼容性，也開始應(yīng)用于mamp及相關(guān)物質(zhì)的手性拆分。對(duì)于司法鑒定和興奮劑檢測常用的人體生物樣本，基質(zhì)成分十分復(fù)雜，往往存在大量高濃度的胺類結(jié)構(gòu)類似物，容易對(duì)檢測結(jié)果造成干擾。同時(shí)，過量的衍生化試劑和緩沖溶液的加入也進(jìn)一步增加的檢測樣本的復(fù)雜性，影響檢測的準(zhǔn)確性和靈敏度。因此，建立一種重復(fù)性好，準(zhǔn)確度和靈敏度高的手性衍生檢測方法是十分必需的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種甲基苯丙胺和苯丙胺對(duì)映異構(gòu)體的手性衍生檢測方法，將該方法用于復(fù)雜生物樣本中甲基苯丙胺和苯丙胺的對(duì)映異構(gòu)體檢測，該方法不僅具有良好的分離度，且重復(fù)性好，靈敏度高，在司法鑒定和興奮劑篩查方面均具有良好的實(shí)用性。

2、本發(fā)明提供了一種甲基苯丙胺和苯丙胺對(duì)映異構(gòu)體的手性衍生檢測方法，至少包括以下步驟：

3、(1)待測樣本中加入內(nèi)標(biāo)溶液、緩沖溶液和衍生化試劑進(jìn)行衍生化反應(yīng)；

4、(2)衍生化反應(yīng)后加入萃取劑進(jìn)行液液萃取，將液液萃取后的有機(jī)相吹干后用復(fù)溶溶劑復(fù)溶得到復(fù)溶溶液；

5、(3)將復(fù)溶溶液進(jìn)行液相色譜-高分辨質(zhì)譜檢測，并根據(jù)檢測結(jié)果進(jìn)行定性和半定量測定。

6、作為一種優(yōu)選的技術(shù)方案，所述待測樣本包括人的血液，尿液，唾液和汗液。

7、作為一種優(yōu)選的技術(shù)方案，所述緩沖溶液的ph為7-12，優(yōu)選為8.0-9.0。

8、作為一種優(yōu)選的技術(shù)方案，所述緩沖溶液為碳酸氫鈉緩沖溶液，所述碳酸氫鈉緩沖溶液的濃度為0.5-21mol/l，優(yōu)選為1±0.1mol/l。

9、作為一種優(yōu)選的技術(shù)方案，所述內(nèi)標(biāo)溶液的制備方法為：將(±)-d9-methamphetamine(d9-mamp)和(±)-d10-amphetamine-(d10-amp)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用溶劑稀釋為濃度為200-300ng/ml的混合溶液即為內(nèi)標(biāo)溶液。

10、優(yōu)選的，所述溶劑為甲醇。

11、作為一種優(yōu)選的技術(shù)方案，所述衍生化試劑為marfey(1-氟-2,4-二硝基苯基-5-l-丙氨酸酰胺)溶液。

12、優(yōu)選的，所述marfey溶液的濃度為3-7mg/ml，優(yōu)選為4-6mg/ml，最優(yōu)選為5±0.5mg/ml。

13、優(yōu)選的，所述marfey溶液的溶劑為dmso(二甲基亞砜)。

14、作為一種優(yōu)選的技術(shù)方案，所述待測樣本的用量為50-200μl，內(nèi)標(biāo)溶液的用量為10-30μl，緩沖溶液的用量為20-60μl，衍生化試劑與待測樣本的體積比為1：(0.8-1.5)。

15、作為一種優(yōu)選的技術(shù)方案，所述衍生化反應(yīng)的溫度為40-60℃，衍生化時(shí)間為0.5-2h。優(yōu)選的，所述衍生化反應(yīng)的溫度為45-55℃，衍生化時(shí)間為1-2h。

16、作為一種優(yōu)選的技術(shù)方案，所述萃取劑為醇醚類萃取劑，優(yōu)選為甲基叔丁基醚。

17、作為一種優(yōu)選的技術(shù)方案，所述萃取劑的加入量為0.8-1.5ml。

18、作為一種優(yōu)選的技術(shù)方案，所述液液萃取具體為：將加入萃取劑的反應(yīng)體系進(jìn)行渦旋后離心實(shí)現(xiàn)分層獲得有機(jī)相。

19、作為一種優(yōu)選的技術(shù)方案，所述復(fù)溶溶劑為甲醇水溶液。

20、優(yōu)選的，所述甲醇水溶液中甲醇的質(zhì)量占比為50-65％。

21、作為一種優(yōu)選的技術(shù)方案，所述液相色譜-高分辨質(zhì)譜檢測中液相色譜分離條件為：采用反相c18柱，流動(dòng)相由流動(dòng)相a和流動(dòng)相b組成，流動(dòng)相a為濃度為2-6mm甲酸銨水溶液，流動(dòng)相b為甲醇，采用梯度洗脫程序，流速為0.25±0.02ml/min，柱溫為40±2℃，進(jìn)樣量為2-10μl。

22、作為一種優(yōu)選的技術(shù)方案，所述反相c18柱為waters?acquity?uplc?beh?c18，規(guī)格為100mm*2.1mm，1.7μm粒徑。

23、作為一種優(yōu)選的技術(shù)方案，所述梯度洗脫程序參見表1。

24、表1

25、 時(shí)間(分鐘) a％ b％ 0 50％ 50％ 10 30％ 70％ 15 30％ 70％ 15.1 0％ 100 16 0％ 100 16.1 50％ 50 21 50％ 50

26、作為一種優(yōu)選的技術(shù)方案，所述液相色譜-高分辨質(zhì)譜檢測中高分辨質(zhì)譜檢測條件為：所述質(zhì)譜為四級(jí)桿靜電場軌道阱質(zhì)譜，采用電噴霧離子源(esi源)負(fù)離子模式，離子源電壓為2.8kv-3.0kv，鞘氣氣壓為32-38arb，輔助氣氣壓為12-18arb，輔助氣溫度為300-380℃，毛細(xì)管溫度300-330℃，采用平行反應(yīng)監(jiān)測模式(prm)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。

27、作為一種優(yōu)選的技術(shù)方案，所述平行反應(yīng)監(jiān)測模式下，二級(jí)質(zhì)譜的歸一化碎裂能量(nce)設(shè)置為30-35，優(yōu)選為35。

28、目前，甲基苯丙胺和苯丙胺對(duì)映異構(gòu)體的手性衍生檢測方法通常在衍生化反應(yīng)之后加入鹽酸中和后濃縮/稀釋后直接上機(jī)檢測，但是鹽酸的加入導(dǎo)致體系中鹽濃度過高，質(zhì)譜信號(hào)噪聲顯著升高，檢測靈敏度不夠理想?；诖?，本發(fā)明通過優(yōu)化手性衍生反應(yīng)和液液萃取技術(shù)相結(jié)合，面對(duì)基質(zhì)成分十分復(fù)雜的生物樣本，能夠有效克服大量高濃度的胺類結(jié)構(gòu)類似物的存在對(duì)檢測結(jié)果造成的干擾，不僅能夠?qū)崿F(xiàn)甲基苯丙胺和丙苯胺對(duì)映異構(gòu)體的區(qū)分，同時(shí)可以對(duì)樣本進(jìn)行純化，提高檢測靈敏度。

29、具體的，為了獲得最佳的分離檢測效果，本發(fā)明在方法優(yōu)化的過程中，前期在衍生化反應(yīng)結(jié)束后加入ph調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)體系ph后再進(jìn)行后續(xù)液液萃取，包括向衍生化反應(yīng)結(jié)束后的體系中加入鹽酸溶液、碳酸鈉飽和溶液后進(jìn)行液液萃取，但是加入鹽酸后的液液萃取效率較低，且重復(fù)性較差，加入碳酸鈉飽和溶液也會(huì)導(dǎo)致萃取效率變差，因此本發(fā)明確定了在衍生化反應(yīng)結(jié)束后，不再加入ph調(diào)節(jié)劑，直接通過液液萃取終止衍生化反應(yīng)，由此同時(shí)實(shí)現(xiàn)了甲基苯丙胺和苯丙胺的富集和純化。

30、進(jìn)一步的，本發(fā)明通過控制衍生化試劑的添加量以及衍生化反應(yīng)的溫度和時(shí)間，顯著增加甲基苯丙胺和苯丙胺的質(zhì)譜響應(yīng)的同時(shí)控制衍生化反應(yīng)在溫和的溫度下快速進(jìn)行，且具有良好的穩(wěn)健度。

31、進(jìn)一步的，本發(fā)明通過控制待測物及內(nèi)標(biāo)的prm監(jiān)測參數(shù)中，二級(jí)質(zhì)譜的歸一化碎裂能量(nce)為30-35，甲基苯丙胺和苯丙胺的主要碎片離子的質(zhì)譜響應(yīng)最高，進(jìn)而獲得最佳的檢測靈敏度。

32、此外，本發(fā)明采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為色譜固定相，相比手性冠醚硅膠固定相(色譜柱為supelcoastec?chirobiotictmv2手性柱，2.1mm×250mm，5μm)，具有價(jià)格低廉的優(yōu)勢，有效降低了成本。

33、綜上，本發(fā)明通過marfey試劑與對(duì)映異構(gòu)體氨基或亞氨基的化學(xué)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)手性拆分，方法靈敏度高、準(zhǔn)確性好、耐用性好、操作方便，且可進(jìn)一步擴(kuò)展至不斷出現(xiàn)的新型胺類興奮劑和精神活性藥物的手性拆分，在司法檢測和興奮劑篩查中具有良好的現(xiàn)實(shí)意義。

34、有益效果

35、1、本發(fā)明提供了一種甲基苯丙胺和苯丙胺對(duì)映異構(gòu)體的手性衍生檢測方法，將該方法用于復(fù)雜生物樣本中甲基苯丙胺和苯丙胺的對(duì)映異構(gòu)體檢測，該方法不僅具有良好的分離度，且重復(fù)性好，靈敏度高，在司法鑒定和興奮劑篩查方面均具有良好的實(shí)用性。

36、2、本發(fā)明通過優(yōu)化手性衍生反應(yīng)和液液萃取技術(shù)相結(jié)合，面對(duì)基質(zhì)成分十分復(fù)雜的生物樣本，能夠有效克服大量高濃度的胺類結(jié)構(gòu)類似物的存在對(duì)檢測結(jié)果造成的干擾，不僅能夠?qū)崿F(xiàn)甲基苯丙胺和丙苯胺對(duì)映異構(gòu)體的區(qū)分，同時(shí)可以對(duì)樣本進(jìn)行純化，提高檢測靈敏度。

37、3、本發(fā)明確定了在衍生化反應(yīng)結(jié)束后，不再加入ph調(diào)節(jié)劑，直接通過液液萃取終止衍生化反應(yīng)，由此同時(shí)實(shí)現(xiàn)了甲基苯丙胺和苯丙胺的富集和純化。

38、4、本發(fā)明通過控制衍生化試劑的添加量以及衍生化反應(yīng)的溫度和時(shí)間，顯著增加甲基苯丙胺和苯丙胺的質(zhì)譜響應(yīng)的同時(shí)控制衍生化反應(yīng)在溫和的溫度下快速進(jìn)行，且具有良好的穩(wěn)健度。

39、5、本發(fā)明通過控制待測物及內(nèi)標(biāo)的prm監(jiān)測參數(shù)中，二級(jí)質(zhì)譜的歸一化碎裂能量(nce)為30-35，甲基苯丙胺和苯丙胺的主要碎片離子的質(zhì)譜響應(yīng)最高，進(jìn)而獲得最佳的檢測靈敏度。