本發(fā)明屬于生物檢測(cè)，尤其是涉及一種同時(shí)檢測(cè)土壤中吸附和脫附態(tài)抗生素生物可利用性的方法。

背景技術(shù)：

1、在人類醫(yī)學(xué)和動(dòng)物農(nóng)業(yè)中對(duì)抗生素的過度使用造成了環(huán)境中抗生素耐藥性的發(fā)生和發(fā)展，并且抗生素耐藥基因(args)可以在細(xì)菌間進(jìn)行水平基因轉(zhuǎn)移，獲得args的病原菌能夠減弱抗生素臨床治療的效果，這無疑對(duì)人類的健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。四環(huán)素類抗生素是動(dòng)物生產(chǎn)中使用最多的藥物之一，它們的大部分經(jīng)動(dòng)物的排泄物排出，繼而通過糞肥和污水回用導(dǎo)致土壤中四環(huán)素的廣泛殘留。四環(huán)素在土壤中的存在是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，通常被土壤顆粒(包括礦物和有機(jī)質(zhì)等)吸附以及隨后的脫附。了解細(xì)菌對(duì)土壤中吸附和脫附態(tài)四環(huán)素類抗生素的獲取和吸收(即生物有效性)對(duì)于影響args在土壤微生物群落中的產(chǎn)生與傳播是至關(guān)重要的。但是目前國際上尚無有效的手段進(jìn)行吸附態(tài)和解析態(tài)抗生素同時(shí)檢測(cè)的技術(shù)手段。因此，亟需開發(fā)能夠同時(shí)檢測(cè)土壤中吸附和脫附態(tài)四環(huán)素的生物可利用性的技術(shù)方法并將其應(yīng)用于實(shí)際環(huán)境檢測(cè)中。

2、當(dāng)前采用熒光傳感細(xì)菌對(duì)抗生素或其他有機(jī)化合物的檢測(cè)已經(jīng)受到認(rèn)可，用其檢測(cè)環(huán)境中抗生素的生物可利用性是可行的技術(shù)手段。然而，現(xiàn)階段的發(fā)明或研究主要針對(duì)于熒光傳感細(xì)菌的開發(fā)與構(gòu)建，對(duì)于如何將這些菌株應(yīng)用于檢測(cè)實(shí)際環(huán)境中抗生素生物可利用性的發(fā)明卻較少，特別是將其應(yīng)用于土壤中吸附和脫附態(tài)抗生素生物可利用性的同時(shí)檢測(cè)。這主要涉及到熒光傳感細(xì)菌在復(fù)雜環(huán)境條件下的穩(wěn)定性、檢測(cè)限和長期檢測(cè)能力等問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種同時(shí)檢測(cè)土壤中吸附和脫附態(tài)抗生素生物可利用性的方法。

2、本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種生物傳感檢測(cè)體系，包括含有瓊脂的固體培養(yǎng)基含有篩選抗生素，以及涂布在含有瓊脂的固體培養(yǎng)基上的e.coli?ptgm熒光傳感細(xì)菌，e.coli?ptgm熒光傳感細(xì)菌能夠與篩選抗生素相應(yīng)。

3、優(yōu)選地，e.coli?ptgm熒光傳感細(xì)菌含有攜帶四環(huán)素耐藥基因tet(m)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因tetr和綠色熒光蛋白基因(gfp)的ptgm質(zhì)粒。

4、優(yōu)選地，培養(yǎng)基為含有100mg/l氨芐青霉素和2％(w/v)瓊脂的lb固體培養(yǎng)基。

5、優(yōu)選地，將e.coli?ptgm熒光傳感細(xì)菌培養(yǎng)至od600為0.4-0.6時(shí)，涂布到培養(yǎng)基上。

6、使用生物傳感檢測(cè)體系檢測(cè)土壤中抗生素生物可利用性的方法，將待測(cè)土壤樣本置于固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后觀察土壤樣本周邊是否形成熒光物，判斷該土壤樣本中是否含有生物可利用性抗生素。

7、優(yōu)選地，抗生素為四環(huán)素類抗生素，優(yōu)選為四環(huán)素、土霉素和金霉素中的一種或多種；

8、同時(shí)檢測(cè)土壤中吸附態(tài)生物可利用性抗生素和/或解吸態(tài)生物可利用性抗生素。

9、優(yōu)選地，具體方法如下：

10、步驟一：取待測(cè)的未知土壤，對(duì)其依次進(jìn)行研磨、過篩和滅菌；

11、步驟二：向lb培養(yǎng)基中加入2％(w/v)的瓊脂，滅菌后加入氨芐青霉素至100mg/l，置入培養(yǎng)皿后凝固；將含有攜帶四環(huán)素耐藥基因tet(m)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因tetr和綠色熒光蛋白基因(gfp)的ptgm質(zhì)粒的e.coli?ptgm熒光傳感細(xì)菌涂布在培養(yǎng)皿上；

12、步驟三：將土壤樣本置于培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后觀察是否產(chǎn)生熒光光圈，判斷土壤樣本中是否含有生物可利用性抗生素。

13、優(yōu)選地，還包括步驟四；

14、步驟四：分別收集土壤樣本和光圈范圍培養(yǎng)基樣本上的菌群進(jìn)行提取，檢測(cè)計(jì)算平均熒光強(qiáng)度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，得知樣本中可生物利用的抗生素濃度。

15、優(yōu)選地，使用激光共聚焦顯微鏡可對(duì)土壤和瓊脂表面進(jìn)行直接成像，檢測(cè)形成熒光物的熒光強(qiáng)度；

16、或者，采用碘曲侖密度梯度分離法對(duì)e.coli?ptgm菌落進(jìn)行提取并使用流式細(xì)胞儀測(cè)定每個(gè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。

17、優(yōu)選地，待測(cè)土壤樣本的水勢(shì)范圍為-10.59～-2.95kpa。

18、本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是：本發(fā)明所涉及的生物傳感檢測(cè)體系，方便快捷、靈敏度高，低耗環(huán)保，可實(shí)現(xiàn)對(duì)土壤中吸附和脫附態(tài)的四環(huán)素類抗生素生物可利用性的同時(shí)檢測(cè)；并且該生物傳感檢測(cè)體系使用范圍廣泛，能夠應(yīng)用于多種不同水勢(shì)的土壤中，對(duì)其中的吸附和脫附態(tài)的抗生素生物可利用性同時(shí)檢測(cè)，為及時(shí)有效的監(jiān)控環(huán)境中抗生素的行為提供重要的技術(shù)支持。

技術(shù)特征：

1.一種生物傳感檢測(cè)體系，其特征在于：包括含有瓊脂的固體培養(yǎng)基含有篩選抗生素，以及涂布在含有瓊脂的固體培養(yǎng)基上的e.coli?ptgm熒光傳感細(xì)菌，e.coli?ptgm熒光傳感細(xì)菌能夠與篩選抗生素相應(yīng)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物傳感檢測(cè)體系，其特征在于：e.coliptgm熒光傳感細(xì)菌含有攜帶四環(huán)素耐藥基因tet(m)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因tetr和綠色熒光蛋白基因(gfp)的ptgm質(zhì)粒。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生物傳感檢測(cè)體系，其特征在于：所述培養(yǎng)基為含有100mg/l氨芐青霉素和2％(w/v)瓊脂的lb固體培養(yǎng)基。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生物傳感檢測(cè)體系，其特征在于：將e.coliptgm熒光傳感細(xì)菌培養(yǎng)至od600為0.4-0.6時(shí)，涂布到培養(yǎng)基上。

5.使用權(quán)利要求1-4中任一所述的生物傳感檢測(cè)體系同時(shí)檢測(cè)土壤中吸附和脫附態(tài)抗生素生物可利用性的方法，其特征在于：將待測(cè)土壤樣本置于固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后觀察土壤樣本周邊是否形成熒光物，判斷該土壤樣本中是否含有生物可利用性抗生素。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的同時(shí)檢測(cè)土壤中吸附和脫附態(tài)抗生素生物可利用性的方法，其特征在于：抗生素為四環(huán)素類抗生素，優(yōu)選為四環(huán)素、土霉素和金霉素中的一種或多種；

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的同時(shí)檢測(cè)土壤中吸附和脫附態(tài)抗生素生物可利用性的方法，其特征在于：具體方法如下：

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的同時(shí)檢測(cè)土壤中吸附和脫附態(tài)抗生素生物可利用性的方法，其特征在于：還包括步驟四；

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的同時(shí)檢測(cè)土壤中吸附和脫附態(tài)抗生素生物可利用性的方法，其特征在于：使用激光共聚焦顯微鏡可對(duì)土壤和瓊脂表面進(jìn)行直接成像，檢測(cè)形成熒光物的熒光強(qiáng)度；

10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的同時(shí)檢測(cè)土壤中吸附和脫附態(tài)抗生素生物可利用性的方法，其特征在于：待測(cè)土壤樣本的水勢(shì)范圍為-10.59～-2.95kpa。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種同時(shí)檢測(cè)土壤中吸附和脫附態(tài)抗生素生物可利用性的方法，屬于生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域。本發(fā)明采用熒光傳感細(xì)菌與瓊脂平板相結(jié)合的方法設(shè)計(jì)了一種生物傳感檢測(cè)體系，基于土壤?抗生素的界面行為及瓊脂擴(kuò)散原理，通過控制瓊脂平板體系的濕度，該體系可以對(duì)不同水勢(shì)的土壤中吸附和脫附的四環(huán)素的生物可利用性進(jìn)行檢測(cè)并同時(shí)量化。本發(fā)明設(shè)計(jì)的生物傳感檢測(cè)體系簡(jiǎn)易靈敏、低耗便捷，可原位檢測(cè)水勢(shì)范圍為?10.59～?2.95Kpa的土壤，對(duì)四環(huán)素類抗生素的最低檢測(cè)限值為1mg/kg。

技術(shù)研發(fā)人員：陳則友,袁勝煜,王美侖,王星爍
受保護(hù)的技術(shù)使用者：南開大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/2