本發(fā)明涉及使用與腫瘤標(biāo)記等反應(yīng)并發(fā)出熒光的熒光診斷劑進(jìn)行熒光圖像診斷時(shí)的組織的預(yù)處理方法。

背景技術(shù)：

1、癌癥手術(shù)的成功取決于早期且準(zhǔn)確地確定癌細(xì)胞位置及其完全去除。因此，需要手術(shù)中腫瘤區(qū)域的可視化，還開發(fā)了對腫瘤起特異反應(yīng)的熒光探針(非專利文獻(xiàn)1～8)。但是，僅將熒光探針直接涂布在腫瘤區(qū)域，存在早期得不到充足的熒光強(qiáng)度、難以與細(xì)胞本來就有的自發(fā)光相區(qū)分、及熒光快速消失等問題。因此，研究著使用kinetic?map的癌癥區(qū)域確定方法(非專利文獻(xiàn)9)；切斷、壓縮和清洗處理(非專利文獻(xiàn)10)；multispectral?open-air法(非專利文獻(xiàn)11)以及與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)交聯(lián)的熒光探針(非專利文獻(xiàn)12)。

2、現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)

3、非專利文獻(xiàn)

4、非專利文獻(xiàn)1:yasuteru?urano等，science?translational?medicine；3(110)：110-119(2011)

5、非專利文獻(xiàn)2:yoichi?miyata等，scientific?reports；7:36542(2017)

6、非專利文獻(xiàn)3:takeshi?mizushima等，bmc?cancer；16；411(2016)

7、非專利文獻(xiàn)4:yasuteru?urano,current?opinion?in?chemical?biology；16:602-608(2012)

8、非專利文獻(xiàn)5:makoto?mitsunaga等，gut；62:1179-1186(2013)

9、非專利文獻(xiàn)6:hiroaki?ueo等，scientific?reports；5:12080(2015)

10、非專利文獻(xiàn)7:yoshiaki?shinden等,scientific?reports；6:27525(2016)

11、非專利文獻(xiàn)8:haruaki?hino等,translational?oncology；9:203-210(2016)非專利文獻(xiàn)9:yuko?nakamura等,oncotarget；7(32)：51124-51137(2016)

12、非專利文獻(xiàn)10:toshiko?harada等,contrast?media?mo.imaging(2016)doi:10.1002/cmmi.1775

13、非專利文獻(xiàn)11:ali?behrooz等,optics?letters；42(15)：2964-2967(2017)非專利文獻(xiàn)12:yuko?nakamura等,oncotarget；8(24)：39512-39521(2017)

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、發(fā)明所要解決的問題

2、本發(fā)明的發(fā)明人對使用熒光探針的細(xì)胞團(tuán)塊或組織的染色進(jìn)行研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)盡管臨床中通過手術(shù)摘除的組織和淋巴結(jié)等明顯是癌癥，但是即使使熒光探針接觸，也會有觀察不到可以與非癌癥區(qū)域區(qū)分的熒光的情況。本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)行進(jìn)一步研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使熒光探針接觸癌細(xì)胞團(tuán)塊時(shí)，表面的癌細(xì)胞迅速地?zé)晒獍l(fā)光，但是另一方面，內(nèi)部的癌細(xì)胞需要花費(fèi)很多時(shí)間才能發(fā)光。由此，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)新的問題：通過使用以前的利用熒光探針檢測癌細(xì)胞的方法，難以檢測到不存在于細(xì)胞團(tuán)塊表面的癌細(xì)胞。因此，本發(fā)明的目的在于提供使靶細(xì)胞迅速發(fā)光的方法，該靶細(xì)胞存在于細(xì)胞團(tuán)塊內(nèi)部且通過熒光探針可以使其發(fā)光。

3、用于解決問題的方法

4、關(guān)于對包含通過熒光探針使其發(fā)出熒光的靶細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)塊進(jìn)行多種處理以改善發(fā)光，本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過去除包含靶細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)塊內(nèi)的鈣離子，能夠使細(xì)胞團(tuán)塊內(nèi)部都迅速發(fā)光，從而完成了本發(fā)明。本發(fā)明的處理方法是一種不論細(xì)胞的種類和熒光探針的種類，而可以利用任意粘附細(xì)胞和任意熒光探針的通用的方法。

5、因此，本發(fā)明涉及以下內(nèi)容：

6、(1)一種使靶細(xì)胞進(jìn)行熒光發(fā)光的方法，包括：

7、去除包含該靶細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)塊或組織內(nèi)的鈣離子的步驟；以及

8、使熒光探針與該細(xì)胞團(tuán)塊或組織接觸的步驟，上述熒光探針通過與該靶細(xì)胞接觸或者被并入到該靶細(xì)胞內(nèi)部而能夠發(fā)出熒光。

9、(2)如(1)所述的方法，其為使靶細(xì)胞團(tuán)塊內(nèi)部進(jìn)行熒光發(fā)光的方法，或者為使細(xì)胞團(tuán)塊或組織內(nèi)部存在的靶細(xì)胞進(jìn)行熒光發(fā)光的方法。

10、(3)一種確定靶細(xì)胞的存在區(qū)域的方法，包括：

11、去除被認(rèn)為存在該靶細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)塊或組織內(nèi)的鈣離子的步驟；

12、使熒光探針與被認(rèn)為存在該靶細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)塊或組織接觸的步驟，上述熒光探針通過與該靶細(xì)胞接觸或者被并入到該靶細(xì)胞內(nèi)部而能夠發(fā)出熒光；以及

13、確定觀察到由上述熒光探針引起的熒光發(fā)光的區(qū)域?yàn)樯鲜霭屑?xì)胞存在的區(qū)域的步驟。

14、(4)如(1)至(3)中任一項(xiàng)所述的方法，其中，

15、與上述靶細(xì)胞接觸或者被并入其內(nèi)部而發(fā)出熒光的熒光探針為通過與該靶細(xì)胞所含有的物質(zhì)反應(yīng)而發(fā)出熒光、或者通過該靶細(xì)胞的ph等物性而發(fā)出熒光、或者通過該靶細(xì)胞為低氧狀態(tài)而發(fā)出熒光的熒光探針。

16、(5)如(1)至(4)中任一項(xiàng)所述的方法，其中，上述靶細(xì)胞所含有的物質(zhì)為酶、離子、一氧化氮或活性氧物種。

17、(6)如(5)所述的方法，其中，上述酶為糖苷酶，蛋白酶或肽酶。

18、(7)如(5)或(6)所述的方法，上述酶為存在于細(xì)胞膜表面的酶。

19、(8)如(5)所述的方法，其中，上述離子為鈣離子或金屬離子。

20、(9)如(1)至(8)中任一項(xiàng)所述的方法，上述鈣離子的去除通過在含有金屬離子螯合劑的緩沖液或不含鈣的緩沖液中浸漬包含該靶細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)塊或組織來進(jìn)行。

21、(10)如(9)所述的方法，其特征在于，上述浸漬進(jìn)行30秒～30分鐘。

22、(11)如(1)至(10)中任一項(xiàng)所述的方法，與上述熒光探針的接觸步驟在ph6～8條件下進(jìn)行。

23、(12)如(1)至(11)中任一項(xiàng)所述的方法，上述靶細(xì)胞為癌細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞。

24、(13)如(12)所述的方法，癌為實(shí)體癌。

25、(14)如(1)至(13)中任一項(xiàng)所述的方法，該方法是使靶細(xì)胞發(fā)出能夠從非靶細(xì)胞中識別出靶細(xì)胞的強(qiáng)度的熒光。

26、(15)如(1)至(14)中任一項(xiàng)所述的方法，其中，上述熒光探針為gglu-hmrg、leu-hmrg、ep-hmrg或ferhonox-1。

27、(16)如(1)至(15)中任一項(xiàng)所述的方法，上述方法離體進(jìn)行。

28、(17)如(1)至(16)中任一項(xiàng)所述的方法，其中，上述方法對生物體內(nèi)的靶細(xì)胞進(jìn)行。

29、(18)一種區(qū)分癌細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞與非癌細(xì)胞或非腫瘤細(xì)胞的方法，包括：

30、通過(12)所述的方法，使癌細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞進(jìn)行熒光發(fā)光的步驟；以及，

31、通過確定發(fā)出熒光的細(xì)胞為癌細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞，確定沒有發(fā)出熒光的細(xì)胞為非癌細(xì)胞或非腫瘤細(xì)胞，來區(qū)分癌細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞與非癌細(xì)胞或非腫瘤細(xì)胞的步驟。

32、(19)一種癌癥或腫瘤的診斷方法，包括：

33、去除來自被檢驗(yàn)者的細(xì)胞團(tuán)塊樣本或組織樣本中的鈣離子的步驟；

34、使熒光探針與該樣本接觸的步驟，上述熒光探針通過與癌細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞接觸或者被并入癌細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞內(nèi)部能夠發(fā)出熒光；以及，

35、該樣本中存在發(fā)出熒光的細(xì)胞時(shí)，診斷為該被檢驗(yàn)者患有癌癥或腫瘤。

36、發(fā)明效果

37、本發(fā)明的使靶細(xì)胞進(jìn)行熒光發(fā)光的方法，因?yàn)槟軌蚴辜?xì)胞團(tuán)塊和組織的內(nèi)部存在的靶細(xì)胞發(fā)光，所以如臨床樣本等可能在表面不一定存在靶細(xì)胞的樣本中，可以使用本發(fā)明檢測靶細(xì)胞。