本發(fā)明涉及一種超靈敏自增強(qiáng)電化學(xué)發(fā)光生物傳感器的構(gòu)建方法以及對(duì)神經(jīng)元特異性烯醇化酶檢測(cè)的應(yīng)用，屬于生化分析、納米材料、生命科學(xué)。

背景技術(shù)：

1、目前，癌癥臨床診斷仍主要依賴(lài)于影像學(xué)，價(jià)格昂貴，待腫瘤發(fā)展到一定程度才能被監(jiān)測(cè)，難以實(shí)現(xiàn)對(duì)癌癥的早期診斷。隨著分子生物學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的快速發(fā)展，大量癌癥相關(guān)的生物標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)，反映了腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展。因此，對(duì)特異性生物標(biāo)志物的靈敏精準(zhǔn)檢測(cè)在癌癥早期預(yù)警和臨床診斷方面具有重要意義。肺癌是起源于支氣管黏膜及腺體的惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率增長(zhǎng)最快，對(duì)人民生命健康造成了巨大威脅。神經(jīng)元特異性烯醇化酶（nse）是小細(xì)胞肺癌診斷的高特異性血清學(xué)生物標(biāo)志物，可作為小細(xì)胞肺癌診斷的有效指標(biāo)。因此，開(kāi)發(fā)有效的檢測(cè)手段以實(shí)現(xiàn)nse的痕量檢測(cè)尤為重要。電化學(xué)發(fā)光（ecl）是由電化學(xué)反應(yīng)引起高能電子轉(zhuǎn)移的化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象，具有高靈敏度、低背景、快速的信號(hào)響應(yīng)等優(yōu)勢(shì)，在生物傳感分析領(lǐng)域備受青睞。因此，高性能ecl生物傳感器的構(gòu)建對(duì)于nse的靈敏檢測(cè)及小細(xì)胞肺癌的早期診斷很有意義。

2、高效發(fā)光體的開(kāi)發(fā)對(duì)于提高ecl生物傳感器的靈敏度至關(guān)重要。金屬有機(jī)框架（mofs）是一種新興的由金屬離子/團(tuán)簇和有機(jī)連接體構(gòu)建的多孔晶體材料，由于其大的表面積、可調(diào)節(jié)的結(jié)構(gòu)和孔徑，在生化分析領(lǐng)域引起了廣泛的興趣。其中，ln-mofs具有獨(dú)特的光化學(xué)性質(zhì)，包括大的斯托克斯位移、尖銳的特征發(fā)射峰、高的色純度、不重疊的光譜和相對(duì)較長(zhǎng)的發(fā)光壽命。因此，ln-mofs被認(rèn)為是一類(lèi)優(yōu)異的發(fā)光物質(zhì)。

3、在三元ecl體系中，共反應(yīng)促進(jìn)劑可以催化共反應(yīng)劑生成更多的活性自由基，以實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大。然而，發(fā)光體和共反應(yīng)促進(jìn)劑屬于不同的功能組分，隨著傳感界面的逐層修飾，二者間的距離變大，且發(fā)光體和催化生成的共反應(yīng)劑自由基的接觸時(shí)間變長(zhǎng)，從而影響ecl體系的輸出信號(hào)。為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提出了一種發(fā)光體與催化劑一體化策略，將催化組分cu2+引入發(fā)光zreu-mof中，促進(jìn)發(fā)光體、共反應(yīng)劑、共反應(yīng)促進(jìn)劑之間的協(xié)同作用，實(shí)現(xiàn)了信號(hào)自增強(qiáng)。此外，在ecl傳感體系中引入猝滅劑，以產(chǎn)生明顯的信號(hào)變化。制備的自增強(qiáng)發(fā)光體與猝滅劑之間的高效ecl共振能量轉(zhuǎn)移極大提高了ecl生物傳感器的檢測(cè)靈敏度，從而更好的滿(mǎn)足nse臨床精準(zhǔn)檢測(cè)的需求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的技術(shù)任務(wù)之一是為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，制備一種集發(fā)光功能與共反應(yīng)促進(jìn)劑催化功能于一體的高效自增強(qiáng)發(fā)光zreucu-mof。

2、本發(fā)明的技術(shù)任務(wù)之二是基于高效自增強(qiáng)發(fā)光zreucu-mof和間苯二酚-甲醛樹(shù)脂-金納米粒子-檢測(cè)抗體猝滅探針構(gòu)建一種超靈敏自增強(qiáng)電化學(xué)發(fā)光生物傳感器，所用原料成本較低，制備工藝簡(jiǎn)單，操作危險(xiǎn)性低。

3、本發(fā)明的技術(shù)任務(wù)之三是提供所述的構(gòu)建方法構(gòu)建的超靈敏自增強(qiáng)電化學(xué)發(fā)光生物傳感器的用途，即用于神經(jīng)元特異性烯醇化酶的痕量檢測(cè)，構(gòu)建的生物傳感器對(duì)nse檢測(cè)具有低的檢測(cè)限，寬的檢測(cè)范圍和良好的穩(wěn)定性，可用于小細(xì)胞肺癌的早期診斷，具有一定的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景。

4、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

5、1.?一種超靈敏自增強(qiáng)電化學(xué)發(fā)光生物傳感器的構(gòu)建方法

6、將10?μl濃度為6?~?10?mg/ml的zreucu-mof溶液、8?μl濃度為1?μg/ml的捕獲抗體溶液、5?μl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的牛血清白蛋白溶液、5?μl的nse溶液、8?μl蛋黃結(jié)構(gòu)的間苯二酚-甲醛樹(shù)脂-金納米粒子-檢測(cè)抗體復(fù)合溶液依次滴涂到電極表面，并于4?℃下進(jìn)行孵育，構(gòu)建了超靈敏自增強(qiáng)電化學(xué)發(fā)光生物傳感器；

7、所述zreucu-mof溶液，是將2.34?g的zrcl4和4.33?g的1,?2,?4,?5-苯四甲酸溶解在70?ml的超純水中，室溫下攪拌30?min；回流24?h后，將所得混合物在9000轉(zhuǎn)下離心，并用超純水洗滌3次；將離心所得固體分散在超純水中并回流16?h，用乙醇離心洗滌3次，在60℃下真空干燥以制得zr-mof；將0.034?g的eucl3·6h2o溶于10?ml乙醇中，加入100?mg制備的zr-mof；將所得混合物在室溫下攪拌20?h，用乙醇離心洗滌3次，在60?℃下真空干燥以制得zreu-mof；將79?mg制備的zreu-mof分散在10?mm的cucl2溶液中，室溫下攪拌1?h后，將所得溶液用超純水離心洗滌3次，并在60?℃下真空干燥，制得zreucu-mof；將所得zreucu-mof分散在超純水中，得到zreucu-mof溶液；

8、所述捕獲抗體溶液，是將捕獲抗體均勻分散于濃度為0.1?m且ph為7.4的磷酸緩沖鹽溶液中，得到捕獲抗體溶液；

9、所述nse溶液，是將nse分別以1?fg/ml、10?fg/ml、100?fg/ml、1?pg/ml、10?pg/ml、100?pg/ml、1?ng/ml、10?ng/ml、50?ng/ml、100?ng/ml的濃度均勻分散于0.1?m且ph為7.4的磷酸緩沖鹽溶液中，得到nse溶液；

10、所述蛋黃結(jié)構(gòu)的間苯二酚-甲醛樹(shù)脂-金納米粒子-檢測(cè)抗體復(fù)合溶液，是將0.2?g的間苯二酚加入到含有8?ml乙醇和20?ml超純水的混合溶液中，超聲混勻；繼續(xù)向上述混合溶液中加入0.54?ml的甲醛溶液，攪拌5?min后，將所得混合溶液冰浴，緩慢加入0.3?ml的nh3·h2o，并持續(xù)攪拌24?h；隨后，將所得懸浮液用超純水和乙醇交替洗滌3次，冷凍干燥12h，得到蛋黃結(jié)構(gòu)的間苯二酚-甲醛樹(shù)脂；將0.05?g蛋黃結(jié)構(gòu)的間苯二酚-甲醛樹(shù)脂加入50ml的金納米粒子溶液中，超聲30?min進(jìn)行混勻，并儲(chǔ)存過(guò)夜；將所得混合溶液用超純水離心3次，隨后冷凍干燥12?h，得到蛋黃結(jié)構(gòu)的間苯二酚-甲醛樹(shù)脂-金納米粒子；將2?mg的蛋黃結(jié)構(gòu)的間苯二酚-甲醛樹(shù)脂-金納米粒子溶于1?ml的ph為7.4的磷酸緩沖鹽溶液中，隨后與1μg/ml的檢測(cè)抗體在4?℃下震蕩8?h，制得蛋黃結(jié)構(gòu)的間苯二酚-甲醛樹(shù)脂-金納米粒子-檢測(cè)抗體復(fù)合溶液；

11、所述每一步溶液的滴涂，均在前一步溶液滴涂完成，并干燥成膜后進(jìn)行操作。

12、2.?所述的構(gòu)建方法構(gòu)建的超靈敏自增強(qiáng)電化學(xué)發(fā)光生物傳感器的用途，用于小細(xì)胞肺癌標(biāo)志物nse檢測(cè)的應(yīng)用

13、以修飾完的玻碳電極為工作電極，鉑絲電極為對(duì)電極，銀/氯化銀電極為參比電極，基于三電極檢測(cè)體系，在10?ml含有80?~?120?mm的k2s2o8且ph為6.5磷酸緩沖鹽溶液中測(cè)試其ecl性能；實(shí)驗(yàn)施加的掃描電位范圍為-1.8?~?0?v，光電倍增管高壓為800?v，掃描速率為150?mv/s；根據(jù)ecl測(cè)試結(jié)果繪制線性關(guān)系曲線，可得構(gòu)建的生物傳感器的適用檢測(cè)范圍為1?fg/ml?~?100?ng/ml，具有高效的分析檢測(cè)能力；根據(jù)對(duì)多種干擾物質(zhì)的信號(hào)測(cè)試結(jié)果，表明構(gòu)建的生物傳感器具有高的特異性；根據(jù)多次循環(huán)測(cè)試結(jié)果，可得構(gòu)建的生物傳感器具有良好的穩(wěn)定性；根據(jù)不同批次生物傳感器的信號(hào)響應(yīng)，可得構(gòu)建的生物傳感器具有良好的再現(xiàn)性。

14、本發(fā)明的有益的技術(shù)效果：

15、1.?本發(fā)明制得了一種集發(fā)光和催化功能于一體的高效自增強(qiáng)發(fā)光zreucu-mof；發(fā)光體與共反應(yīng)促進(jìn)劑的集成促使電極表面生成了更多的自由基，并縮短了發(fā)光體與共反應(yīng)劑自由基之間的接觸時(shí)間，增強(qiáng)了發(fā)光體、共反應(yīng)劑、共反應(yīng)促進(jìn)劑之間的協(xié)同作用，實(shí)現(xiàn)了輸出信號(hào)的有效擴(kuò)增。

16、2.?本發(fā)明構(gòu)建了一種超靈敏自增強(qiáng)電化學(xué)發(fā)光生物傳感器，基于自增強(qiáng)發(fā)光zreucu-mof和高效的間苯二酚-甲醛樹(shù)脂-金納米粒子-檢測(cè)抗體猝滅探針，產(chǎn)生了明顯的信號(hào)“開(kāi)-關(guān)”變化，極大提升了ecl生物傳感器的檢測(cè)靈敏度。

17、3.?本發(fā)明構(gòu)建的超靈敏自增強(qiáng)電化學(xué)發(fā)光生物傳感器對(duì)nse檢測(cè)具有低的檢出限，寬的線性范圍，以及優(yōu)異的穩(wěn)定性、特異性和重現(xiàn)性，可用于小細(xì)胞肺癌的早期預(yù)警和及時(shí)診斷；ecl生物傳感器制備工藝簡(jiǎn)單，成本較低，具有一定的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景。