本發(fā)明屬于中藥檢測，具體涉及細葉鐵線蓮藥材中黃酮成分含量測定方法。

背景技術(shù)：

1、細葉鐵線蓮（clematis?aethusifolia?turcz）是毛茛科鐵線蓮屬草質(zhì)藤本，又名芹葉鐵線蓮，蒙文名為“特穆日-敖日陽古”，夏季花盛開時采收，曬干或切段曬干，性味辛、微甘，熱，輕，銳，燥，糙；有毒，有“破痞，調(diào)溫，燥“協(xié)日烏素”,止腐，消腫，止瀉”功效。主要用于寒痞，消化不良，寒性“協(xié)日烏素”病，“吾雅曼”病，黃水瘡，創(chuàng)瘍，水腫，寒瀉。

2、現(xiàn)代研究表明，細葉鐵線蓮中分離鑒定的化學成分主要包括黃酮、木脂素、苯丙酸衍生物、香豆素、以及皂苷類等，其中黃酮類成分的活性苷元主要是槲皮素、木犀草素、山柰酚和芹菜素等。

3、本發(fā)明采用高效液相色譜法建立細葉鐵線蓮藥材中黃酮成分槲皮素、木犀草素、山柰酚、芹菜素的含量測定方法，為鐵線蓮屬藥材的質(zhì)量控制以及提升和完善細葉鐵線蓮藥材質(zhì)量標準提供參考。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種細葉鐵線蓮藥材中黃酮成分含量測定方法。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

3、本發(fā)明所述的細葉鐵線蓮藥材中黃酮成分含量測定方法，采用了高效液相色譜法同時測定了細葉鐵線蓮藥材中主要黃酮有效成分槲皮素、木犀草素、山柰酚、芹菜素的含量。本發(fā)明測定的主要有效成分均是黃酮類成分，具有抗氧化、抗炎、抗菌、改善心血管健康、吸收紫外輻射和抗過敏作用等生物活性作用。

4、本發(fā)明所述高效液相色譜法的色譜條件為：色譜柱為c18色譜柱；流動相為甲醇?-0.2%磷酸水溶液（50:50，v/v）；流速：1.0?ml/min；檢測波長為360?nm；柱溫為25℃。

5、本發(fā)明所述的高效液相色譜法采用的色譜柱為uitimate?xb-c18（4.6?mm×250mm，5?μm），該色譜柱是十八烷基硅烷鍵合硅膠的反相色譜柱，其硅膠顆粒粒徑為5?μm，柱長為250?mm，柱內(nèi)徑為4.6?mm。本發(fā)明比較了150?mm與250?mm兩種長度的c18色譜柱，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用150?mm長度的c18色譜柱，山柰酚與芹菜素分離度小于1.0，而使用250?mm的c18色譜柱可以使山柰酚與芹菜素的分離度大于1.5。

6、本發(fā)明所述色譜條件的流動相為甲醇?-?0.2%磷酸水溶液（50:50，v/v），其中甲醇為有機相，磷酸水溶液為水相。

7、本發(fā)明比較了0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%磷酸水溶液作為水相，結(jié)果表明0.05%、0.1%磷酸水溶液作為水相，槲皮素和山柰酚色譜峰的拖尾因子大于1.05；0.3%、0.4%磷酸水溶液作為水相，山柰酚與芹菜素色譜峰的分離度小于1.5；0.2%磷酸水溶液作為水相，槲皮素、木犀草素、山柰酚、芹菜素的色譜峰分離度均大于1.5，拖尾因子均在0.95?～1.05之間，理論塔板數(shù)均大于3?000，因此選擇0.2%磷酸水溶液作為水相。

8、本發(fā)明比較了甲醇與0.2%磷酸水溶液按照體積比40:60、45:55、50:50、55:45、60:40作為流動相，結(jié)果表明甲醇與0.2%磷酸水溶液按照體積比40:60、45:55作為流動相，槲皮素、山柰酚色譜峰分離度小于1.5，拖尾因子大于1.05；甲醇與0.2%磷酸水溶液按照體積比55:45、60:40作為流動相，木犀草素、芹菜素的色譜峰分離度小于1.5；甲醇與0.2%磷酸水溶液按照體積比50:50作為流動相，槲皮素、木犀草素、山柰酚、芹菜素的色譜峰分離度均大于1.5，拖尾因子均在0.95?～?1.05之間，理論塔板數(shù)均大于3000，因此選擇甲醇與0.2%磷酸水溶液按照體積比50:50作為流動相。

9、本發(fā)明所述的甲醇?-?0.5%磷酸水溶液（50:50,?v/v）是無水甲醇與體積分數(shù)為1%的磷酸水溶液，按照體積比為50:50混合配制成的溶液。

10、本發(fā)明所述的甲醇為純度≥99.9%的色譜級甲醇溶液。

11、本發(fā)明所述的供試品溶液制備方法為：細葉鐵線蓮樣品先置40℃鼓風干燥箱24小時，取出，粉碎成細粉，精密稱取細粉3?g，置具塞錐形瓶中，按1:20料液比加入甲醇溶液，超聲提?。囟?0℃，功率250w，頻率40khz）1.5?h，冷卻至室溫，減壓抽濾，濾液減壓濃縮至干，殘渣加入甲醇?-?25%鹽酸溶液（4:1，v/v）混合液25?ml，搖勻，90℃水浴加熱回流0.5?h，冷卻至室溫，過濾，濾液置25?ml容量瓶，加甲醇定容，搖勻，0.45?μm有機微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。黃酮化合物在植物體中通常與糖結(jié)合成苷類，小部分以游離態(tài)（苷元）的形式存在，黃酮苷元的檢測需要通過柱前處理破壞黃酮化合物的糖苷鍵，生成黃酮苷元。因此，本發(fā)明選擇先采用采用有機溶劑超聲的方式提取黃酮，后加酸水解破壞糖苷鍵，生成黃酮苷元。

12、本發(fā)明所述的高效液相色譜法還包括對照品溶液的制備方法，其方法為：精密稱定對照品槲皮素、木犀草素、山柰酚、芹菜素，分別加入甲醇溶解，搖勻，制得各對照品儲備液；精密吸取槲皮素、木犀草素、山柰酚、芹菜素儲備液，置同一容量瓶中，加甲醇定容，制備混合對照品溶液。

13、本發(fā)明所述的高效液相色譜法還包括空白溶液的制備方法，空白溶液方法為：不加鐵線蓮藥材，其余操作同供試品溶液，制得空白溶液。

14、本發(fā)明的有益效果：

15、（1）本發(fā)明建立了高效液相色譜法同時對細葉鐵線蓮藥材中的黃酮指標成分槲皮素、木犀草素、山柰酚、芹菜素進行定量測定研究并通過方法學驗證，結(jié)果表明本方法科學、可行；

16、（2）本發(fā)明相較于分析黃酮糖苷化合物，利用分析主要黃酮苷元成分可更直觀的反映細葉鐵線蓮藥材的黃酮含量，有效減少對照品復雜導致的圖譜無法有效分離，檢測時間短，檢測結(jié)果準確，簡單易行；

17、（3）本發(fā)明的線性范圍廣，重復性良好，樣品處理的方法穩(wěn)定可行，所得供試品溶液在常溫狀態(tài)下具有良好的穩(wěn)定性；

18、（4）本發(fā)明的方法穩(wěn)定準確，可用于細葉鐵線蓮的質(zhì)量評價，可為細葉鐵線蓮的質(zhì)量標準的提升提供參考。

技術(shù)特征：

1.細葉鐵線蓮藥材中多種黃酮成分含量測定方法，其特征在于，采用高效液相色譜法同時測定細葉鐵線蓮藥材中槲皮素、木犀草素、山柰酚、芹菜素四種黃酮苷元的含量。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細葉鐵線蓮藥材中多種黃酮成分含量測定方法，其特征在于，所述高效液相色譜法的色譜條件為：色譜柱為c18色譜柱；流動相為甲醇?-?0.2%磷酸水溶液（50:50，v/v）；流速為1.0?ml/min；檢測波長為360?nm；柱溫為25℃。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的細葉鐵線蓮藥材中多種黃酮成分含量測定方法，其特征在于，所述c18色譜柱是十八烷基硅烷鍵合硅膠的反相色譜柱，其硅膠顆粒粒徑為5?μm，柱長為250?mm，柱內(nèi)徑為4.6?mm。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細葉鐵線蓮藥材中多種黃酮成分含量測定方法，其特征在于，所述高效液相色譜法中供試品溶液制備方法為：細葉鐵線蓮樣品粉碎成細粉，精密稱取細粉3g，置具塞錐形瓶中，按1:20料液比加入甲醇溶液，超聲提取（溫度50℃，功率250w，頻率40khz）1.5?h，冷卻至室溫，減壓抽濾，濾液減壓濃縮至干，殘渣加入甲醇?-?25%鹽酸溶液（4:1，v/v）混合液25?ml，搖勻，90℃水浴加熱回流0.5?h，冷卻至室溫，過濾，濾液置25?ml容量瓶，加甲醇定容，搖勻，0.45?μm有機微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細葉鐵線蓮藥材中多種黃酮成分含量測定方法，其特征在于，所述高效液色譜法中對照品溶液制備方法為：精密稱定對照品槲皮素、木犀草素、山柰酚、芹菜素，分別加入甲醇溶解，搖勻，制得各對照品儲備液；吸取槲皮素、木犀草素、山柰酚、芹菜素儲備液，置同一容量瓶中，加甲醇定容，即得混合對照品溶液。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細葉鐵線蓮藥材中多種黃酮成分含量測定方法，其特征在于，所述高效液相色譜法中進樣量為20?μl。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于中藥檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及蒙藥細葉鐵線藥材中多種黃酮成分含量測定方法，采用高效液相色譜法同時測定細葉鐵線蓮藥材中槲皮素、木犀草素、山柰酚、芹菜素的四種黃酮苷元含量。本發(fā)明可準確測定細葉鐵線蓮藥材中主要黃酮有效成分的含量，具有良好的線性范圍，準確度、精密度和可重復性高，方法穩(wěn)定可行，可應(yīng)用于細葉鐵線蓮藥材的質(zhì)量檢查。

技術(shù)研發(fā)人員：謝和兵,吳浩震,尼瑪次仁,白瑪?shù)┰?br/>受保護的技術(shù)使用者：江蘇神猴醫(yī)藥研究有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/30