本發(fā)明屬于毒品快速檢測(cè)，具體涉及一種快速檢測(cè)唾液中甲基苯丙胺的熒光猝滅免疫層析試紙、其制備方法及應(yīng)用，采用該試紙能夠快速檢測(cè)唾液樣品中甲基苯丙胺的含量。

背景技術(shù)：

1、甲基苯丙胺是在麻黃素化學(xué)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上改造而來(lái)的，外觀為純白結(jié)晶體，因此又叫冰毒。冰毒精神依賴性極強(qiáng)，是目前我國(guó)危害最大的合成毒品。吸食后對(duì)人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有極強(qiáng)的刺激作用，且毒性強(qiáng)烈，大量消耗人的體力，降低免疫功能，嚴(yán)重?fù)p害心臟、大腦組織甚至導(dǎo)致死亡。吸食成癮者還會(huì)造成精神障礙，表現(xiàn)出妄想、好斗、錯(cuò)覺(jué)，從而引發(fā)暴力行為，嚴(yán)重危害社會(huì)治安和公共安全。因此，建立一種快捷準(zhǔn)確的方法來(lái)篩選和檢測(cè)體內(nèi)甲基苯丙胺殘留，可以快速高效甄別吸毒人員，對(duì)于維護(hù)社會(huì)治安具有重要意義。

2、甲基苯丙胺可以使用多種方法進(jìn)行檢測(cè)，如氣相色譜(gc)、高效液相色譜(hplc)、氣相/液相-質(zhì)譜聯(lián)用法(gc/lc-ms-ms)等。這些方法具有極高的靈敏度和準(zhǔn)確性，但是針對(duì)檢測(cè)樣品的前處理過(guò)程復(fù)雜，并依賴于昂貴的設(shè)備、較長(zhǎng)的時(shí)間和專業(yè)的工作人員，通常用來(lái)作為實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，不適合大量樣品的快速篩選，也沒(méi)有辦法現(xiàn)場(chǎng)快速篩查大量樣品。酶聯(lián)免疫吸附法(elisa)和化學(xué)發(fā)光法(cl)因其樣品通量高而備受關(guān)注，并已成功應(yīng)用于甲基苯丙胺的檢測(cè)。然而，它們?nèi)匀皇艿胶臅r(shí)的孵化過(guò)程和多步驟操作的限制，在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中存在著不方便的缺點(diǎn)。

3、相比之下，側(cè)流免疫層析傳感器(lfics)是一種一次性、低成本、快速、特異和敏感的檢測(cè)方法。其中膠體金免疫層析法是以膠體金為標(biāo)記物，利用抗原抗體的特異性反應(yīng)建立的免疫層析技術(shù)，該技術(shù)不需要昂貴的設(shè)備，操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)時(shí)間短(3-5min)，適合樣本的現(xiàn)場(chǎng)批量篩査。然而，盡管這種方法有其優(yōu)點(diǎn)，但使用金納米顆粒的傳統(tǒng)試紙條由于信號(hào)放大有限，通常具有相對(duì)較低的靈敏度；例如中國(guó)專利cn109085347a中，基于金納米顆粒的膠體金免疫層析試紙檢測(cè)唾液中的甲基苯丙胺，其檢出限為50ng/ml。由于靈敏度的限制以及信號(hào)強(qiáng)度的負(fù)讀出，這種方法并不令人滿意。

4、膠體金免疫層析試紙操作簡(jiǎn)便，可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，但靈敏度相對(duì)較低且不能準(zhǔn)確定量，而且檢測(cè)的對(duì)象主要是被檢人的血液和尿液，此類樣品易出現(xiàn)取樣不便、尷尬，需專門(mén)場(chǎng)所的情況，樣品易被掉包、摻假，檢測(cè)結(jié)果易受常見(jiàn)合法藥物干擾出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。

5、本發(fā)明針對(duì)已有的甲基苯丙胺膠體金試紙靈敏度低、易受基質(zhì)干擾、不能準(zhǔn)確定量等缺點(diǎn)，提供了一種用于甲基苯丙胺現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的靈敏度高、簡(jiǎn)便快捷、基質(zhì)干擾小的熒光猝滅免疫層析試紙條的制備方法及定量檢測(cè)的方法，并提供了上述試紙條在唾液基質(zhì)中的應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問(wèn)題，提出了一種快速檢測(cè)唾液中甲基苯丙胺的熒光猝滅免疫層析試紙、其制備方法及應(yīng)用，將發(fā)射波長(zhǎng)為525nm的量子點(diǎn)(qds)作為熒光供體標(biāo)記抗原固定于nc膜上，將吸收波長(zhǎng)為525nm的膠體金(aunps)作為熒光受體與抗體偶聯(lián)，基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fret)原理制備量子點(diǎn)熒光猝滅免疫層析試紙，檢測(cè)結(jié)果與待測(cè)物的濃度呈正相關(guān)，熒光信號(hào)出現(xiàn)即為檢測(cè)限，肉眼更容易捕捉且分辨率高，相較于傳統(tǒng)的免疫層析試紙，靈敏度大大提高。

2、本發(fā)明的技術(shù)方案是：

3、本發(fā)明提供了一種快速檢測(cè)唾液中甲基苯丙胺的熒光猝滅免疫層析試紙，包括樣品墊、玻璃纖維濾紙、金標(biāo)墊、nc膜和吸水墊，所述nc膜上依次設(shè)置量子點(diǎn)偶聯(lián)甲基苯丙胺抗原形成的檢測(cè)線和量子點(diǎn)偶聯(lián)牛血清白蛋白形成的質(zhì)控線，所述金標(biāo)墊上涂有aunps-mab猝滅劑，所述aunps-mab猝滅劑通過(guò)膠體金與甲基苯丙胺抗體偶聯(lián)制得。

4、本發(fā)明在常規(guī)試紙條的組成上增加了玻璃纖維濾紙，以起到在線過(guò)濾作用，實(shí)現(xiàn)了唾液樣品的直接上樣檢測(cè)，從而簡(jiǎn)化了操作步驟，提高了檢測(cè)靈敏度。

5、進(jìn)一步的，所述量子點(diǎn)包括硒化鎘(cdse)、碲化鎘(cdte)、硫化鎘(cds)、硒化鋅(znse)、磷化銦(inp)、砷化銦(inas)，以及cdse核上包裹一層zns或cds組成的納米晶或半導(dǎo)體納米晶。所述量子點(diǎn)作為熒光供體，所述膠體金作為熒光受體。

6、量子點(diǎn)被認(rèn)為具有吸收光譜寬、消光系數(shù)大、光致發(fā)光窄且可調(diào)諧、發(fā)射量子產(chǎn)率高、熒光長(zhǎng)、生物相容性良好等優(yōu)異的光物理特性，該特性使量子點(diǎn)在生物成像和生物傳感中發(fā)揮著重要作用。本發(fā)明采用量子點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)記，使標(biāo)記信號(hào)放大，靈敏度更高。

7、本發(fā)明所用的熒光標(biāo)記材料為粒徑5-20nm范圍的使用聚合物對(duì)油溶性量子點(diǎn)的表面修飾而得到的量子點(diǎn)，可以均勻的分散于水溶液中，表面羧基具有反應(yīng)活性。

8、本發(fā)明原理：熒光淬滅免疫層析試紙條是基于熒光供體與熒光受體的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fret)實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)熒光物質(zhì)接近某些納米材料時(shí)，熒光信號(hào)可以被淬滅。為了達(dá)到最大的fret效率，熒光材料和納米淬滅劑的光譜應(yīng)該表現(xiàn)出明顯的重疊。本發(fā)明所選擇的作為熒光供體的cdse/zns量子點(diǎn)(qds)的最大發(fā)射波長(zhǎng)為525nm，作為熒光受體的膠體金(aunps)在525nm處有最大吸收峰。用qds標(biāo)記甲基苯丙胺抗原并固定于nc膜的檢測(cè)線(t線)上，用于指示待測(cè)物的有無(wú)；用qds標(biāo)記bsa并固定于nc膜的質(zhì)控線(c線)上，用于指示試紙條的有效性；將aunps與甲基苯丙胺抗體偶聯(lián)，并噴涂于金標(biāo)墊上。

9、當(dāng)樣品中不含甲基苯丙胺(met)時(shí)，金標(biāo)抗體(aunps-mab)與t線上量子點(diǎn)偶聯(lián)的甲基苯丙胺抗原(qds-met-bsa)結(jié)合，拉近了熒光供體和受體間的距離，發(fā)生fret使qds的熒光猝滅，t線表現(xiàn)為綠色熒光條帶消失，c線熒光條帶明顯且不變。

10、當(dāng)樣品中含有met時(shí)，met與t線上的抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合aunps-mab，使得t線上與qds-met-bsa結(jié)合的aunps-mab的數(shù)量減少，fret效應(yīng)減弱，t線熒光出現(xiàn)。隨著met濃度的增加，t線熒光強(qiáng)度增大，直至與c線亮度相當(dāng)。

11、如果c、t線均沒(méi)有熒光則說(shuō)明該試紙失效。原理圖見(jiàn)圖1。

12、本發(fā)明還提供了一種所述的熒光猝滅免疫層析試紙的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

13、(1)aunps-mab猝滅劑的制備：將膠體金離心得到的沉淀用pb緩沖液復(fù)溶，調(diào)節(jié)ph為7～8，然后加入甲基苯丙胺抗體，黑暗孵育30～60min；加入bsa溶液封閉膠體金的空白位點(diǎn)，孵育30～60min，將封閉后的溶液4℃離心，棄上清，將沉淀用重懸緩沖液復(fù)溶，4℃避光保存；

14、(2)qds-met-bsa的制備：qds用超純水調(diào)整濃度至1～2μmol/l，加入100mg/mledc/nhs混合液，黑暗中孵育20～30min；加入甲基苯丙胺抗原，黑暗中孵育40～60min；再加入100mg/ml?bsa溶液，黑暗中孵育40～60min；將封閉后的溶液離心，棄上清，沉淀分散于pb緩沖液，4℃避光保存；

15、(3)qds-bsa的制備：qds加入超純水至濃度1～2μmol/l，然后加入100mg/ml?edc/nhs混合液，黑暗中孵育20～30min；加入bsa，黑暗中孵育40～60min，離心，棄上清，沉淀分散于pb緩沖液，4℃避光保存；

16、(4)熒光猝滅免疫層析試紙的制備：將制得的qds-met-bsa和qds-bsa分別以1μl/cm的速度涂于nc膜上，指定為檢測(cè)線和質(zhì)控線，37℃干燥12h；將aunps-mab猝滅劑以6μl/cm噴在金標(biāo)墊上，37℃干燥3h；用含有1％bsa、5％蔗糖和0.6％吐溫-20的pb溶液處理樣品墊和玻璃纖維濾紙，60℃干燥；然后將樣品墊、玻璃纖維濾紙、金標(biāo)墊、nc膜和吸水墊依次重疊2mm并組合在pvc板上。

17、進(jìn)一步的，所述pb緩沖液由0.01m，0.72g?na2hpo4和0.12g?kh2po4溶于500ml水中配制得到。

18、進(jìn)一步的，所述步驟(1)中，膠體金標(biāo)記單抗(aunps-mab)淬滅劑的制備包括以下步驟：

19、濃縮：將膠體金在10000rpm下離心30min，并將沉淀用pb緩沖液(0.01m，0.72gna2hpo4和0.12g?kh2po4溶于500ml水中)復(fù)溶；

20、調(diào)ph：用k2co3(0.2mol/l)調(diào)節(jié)膠體金ph?7～8；

21、偶聯(lián)抗體：加入甲基苯丙胺抗體(met-mab)，黑暗中輕柔攪拌孵育30～60min；

22、封閉：加入bsa溶液(10％，w/v)封閉膠體金的空白位點(diǎn)，孵育30～60min；

23、重懸：將封閉后的溶液4℃，12000rpm離心，棄上清，將沉淀用重懸緩沖液(0.01mpb，含1％bsa、0.1％tween20、5％蔗糖、0.2％peg20000)復(fù)溶，4℃避光保存。

24、進(jìn)一步的，所述步驟(2)中，量子點(diǎn)標(biāo)記物qds-met-bsa的制備包括以下步驟：

25、活化：取0.5～1nmol?qds，用超純水調(diào)整濃度至1～2μmol/l，然后加入60～100μledc/nhs混合液(100mg/ml)，黑暗中孵育20～30min；

26、偶聯(lián)抗原：加入300～400μg甲基苯丙胺抗原，黑暗中孵育40～60min；

27、封閉：再加入100～200μlbsa溶液(100mg/ml)，黑暗中孵育40～60min；

28、重懸：將封閉后的溶液9000rpm離心15～20分鐘，棄上清，沉淀分散于pb緩沖液，4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

29、進(jìn)一步的，所述步驟(3)中，量子點(diǎn)標(biāo)記物qds-bsa的制備包括以下步驟：

30、活化：取0.5～1nmol?qds，加入超純水至濃度為1～2μmol/l，然后加入60～100μledc/nhs混合液(100mg/ml)，黑暗中孵育20～30min；

31、偶聯(lián)bsa：加入10～20mg?bsa，黑暗中孵育40～60min；

32、重懸：將溶液于9000rpm離心15～20分鐘，棄上清，沉淀分散于pb緩沖液，4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

33、本發(fā)明還提供了上述任一項(xiàng)所述的熒光猝滅免疫層析試紙或者上述任一項(xiàng)所述的制備方法制得的熒光猝滅免疫層析試紙?jiān)诳焖贆z測(cè)唾液中甲基苯丙胺中的應(yīng)用。

34、進(jìn)一步的，所述熒光猝滅免疫層析試紙用于定性篩查唾液中的甲基苯丙胺，檢測(cè)步驟包括：

35、將唾液樣品滴到試紙條的樣品墊上，1min后，在紫外燈下觀察t線和c線處熒光的強(qiáng)弱，與標(biāo)準(zhǔn)色卡比較，初步判斷甲基苯丙胺的殘留水平。

36、進(jìn)一步的，所述熒光猝滅免疫層析試紙用于定量檢測(cè)唾液中的甲基苯丙胺，檢測(cè)方法包括：

37、(1)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：用人工唾液配制一系列不同濃度的甲基苯丙胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別滴到試紙條的樣品墊上，1min后，用熒光免疫分析儀采集t線和c線處的熒光信號(hào)，得到相應(yīng)的t線與c線熒光強(qiáng)度比，以標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度的log值為橫坐標(biāo)x，t線與c線熒光強(qiáng)度比為縱坐標(biāo)y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y＝ax+b；

38、(2)試紙條檢測(cè)：取唾液樣品滴加到試紙條樣品墊上，1分鐘后插入熒光檢測(cè)儀中檢測(cè)，獲得唾液樣品的t線與c線熒光強(qiáng)度比；

39、(3)結(jié)果處理：將唾液樣品的t線與c線熒光強(qiáng)度比帶入公式，得到待測(cè)樣品中甲基苯丙胺濃度。

40、本發(fā)明的有益效果：

41、(1)本發(fā)明提供的檢測(cè)試紙操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速、使用方便、靈敏度高、成本低。

42、操作簡(jiǎn)單、使用方便體現(xiàn)在：將唾液樣品直接滴到試紙條的樣品墊中，無(wú)需稀釋及其他前處理步驟，在紫外燈下肉眼觀察c、t線的熒光強(qiáng)度進(jìn)行半定量，用熒光免疫分析儀采集信號(hào)實(shí)現(xiàn)定量。

43、快速檢測(cè)體現(xiàn)在：唾液樣品滴加到樣品墊，1分鐘后熒光信號(hào)即趨于穩(wěn)定，可判讀結(jié)果。

44、靈敏度高體現(xiàn)在：檢測(cè)限為1ng/ml，該靈敏度顯著高于目前已報(bào)道的同類產(chǎn)品。

45、(2)針對(duì)膠體金試紙條不能準(zhǔn)確定量的缺點(diǎn)，本發(fā)明提供的熒光猝滅免疫層析試紙可同時(shí)實(shí)現(xiàn)唾液樣品中甲基苯丙胺殘留的定性篩查和定量檢測(cè)。本發(fā)明的定量方法，借助熒光定量讀卡儀，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)現(xiàn)了唾液中甲基苯丙胺的準(zhǔn)確定量，回收率、精密度均滿足定量要求。

46、(3)針對(duì)目前市面上用于甲基苯丙胺檢測(cè)的試紙適用基質(zhì)多為尿液的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種用于唾液基質(zhì)中甲基苯丙胺的快速檢測(cè)試紙，克服了傳統(tǒng)毒品尿液檢驗(yàn)技術(shù)的種種弊端，如取樣不便、尷尬，需專門(mén)場(chǎng)所，女性嫌疑人需有女性執(zhí)法人員當(dāng)場(chǎng)監(jiān)督，樣品易被掉包、摻假，檢測(cè)結(jié)果易受常見(jiàn)合法藥物干擾出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果等。采用本發(fā)明的檢測(cè)試紙定量檢測(cè)甲基苯丙胺殘留時(shí)，準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定性高。