本發(fā)明涉及質(zhì)譜標(biāo)記探針，尤其涉及一種含硼酸酯裂解位點的磁性化學(xué)選擇性探針試劑盒及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、化學(xué)選擇性探針（chemoselective?probe，cp）是一種質(zhì)譜標(biāo)記探針與相分離結(jié)合的樣品前處理技術(shù)。其特點是在保留傳統(tǒng)質(zhì)譜探針功能與結(jié)構(gòu)（質(zhì)譜增敏基團和反應(yīng)基團）的基礎(chǔ)上，新添加了含裂解位點的連接臂和固相基質(zhì)兩個部分，使探針本身不僅具有標(biāo)記分析物的功能，還可以分離純化復(fù)雜樣品中的分析物。傳統(tǒng)的cp使用流程如下：首先，cp與樣品提取液共孵育，探針的反應(yīng)基團捕獲分析物；然后，通過物理分離方式去除提取液中無關(guān)的多余液體基質(zhì)；接著，在設(shè)計好的裂解條件下，釋放標(biāo)記產(chǎn)物；最后，收集標(biāo)記產(chǎn)物進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜（liquid?chromatograph?mass?spectrometer，lc-ms）分析。

2、由于cp具有提高離子化效率、減少基質(zhì)效應(yīng)、改善色譜分離等作用，十分合適復(fù)雜樣品中小分子化合物的質(zhì)譜分析。目前，cp已被廣泛應(yīng)用于各個研究領(lǐng)域，如腸道菌-宿主共代謝物分析、疾病標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)、代謝物快速篩查、代謝物網(wǎng)絡(luò)分析等。然而，盡管目前代謝組學(xué)的研究非?；钴S，且化學(xué)選擇性探針在代謝物分析方面具有諸多優(yōu)勢。

3、例如文獻(xiàn)（chen?j,?tian?y,?zhang?y-x,?et?al.?chemoselective?probesserving?as?promising?derivatization?tools?in?targeted?metabolomics?research[j].?journal?of?analysis?and?testing,?2020,?4(3):?175-182.）綜述了化學(xué)選擇性探針的工作流程和設(shè)計，介紹了其在天然產(chǎn)物富集、代謝物衍生化等領(lǐng)域的應(yīng)用新進(jìn)展，以及在代謝組學(xué)研究中的潛在應(yīng)用。又例如文獻(xiàn)（garg?n,?conway?l?p,?ballet?c,?et?al.chemoselective?probe?containing?a?unique?bioorthogonal?cleavage?site?forinvestigation?of?gut?microbiota?metabolism[j].?angewandte?chemieinternational?edition,?2018,?57(42):?13805-13809.）中設(shè)計并合成了一種獨特的多功能質(zhì)譜分析化學(xué)探針，其中含有對硝基肉桂酰氧羰基作為新的生物正交切割位點。與磁珠結(jié)合，這種化學(xué)探針可以直接從人體樣本中提取代謝物，并在溫和條件下釋放。

4、然而，現(xiàn)有cp的問題也十分明顯。首先，探針制備復(fù)雜，傳統(tǒng)的逐級修飾法的合成步驟可多達(dá)十幾步；而且，cp的標(biāo)記效率不佳，產(chǎn)物釋放條件苛刻且耗時長。強酸堿或強氧化還原反應(yīng)的釋放條件可能會影響產(chǎn)物穩(wěn)定性，溫和的酶或光裂解耗時漫長，尋找合適的裂解位點極為迫切。其次，穩(wěn)定同位素編碼的探針使用成本高，限制了應(yīng)用與推廣。最后，探針覆蓋度與通量不足。面對相互交錯的代謝網(wǎng)絡(luò)，多類型亞代謝組的同時分析非常有必要。

5、鑒于此，開發(fā)制備簡單，標(biāo)記與釋放迅速，探針使用成本低廉，且具有多種類型分析物標(biāo)記能力的高靈敏度磁性cp具有十分重要的實際應(yīng)用價值和經(jīng)濟價值。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、有鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，在本發(fā)明的第一方面，提供了一種工藝便捷的磁性化學(xué)選擇性探針試劑盒的制備方法，包括如下步驟：

2、（1）采用硅烷偶聯(lián)劑對四氧化三鐵磁性納米顆粒進(jìn)行處理，經(jīng)反應(yīng)使其表面包覆二氧化硅，得到覆硅顆粒；

3、（2）利用甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷（3-methacryloxypropyltrimethoxysilane，γ-mps）對覆硅顆粒進(jìn)行修飾，于覆硅顆粒表面反應(yīng)引入碳碳雙鍵，得到雙鍵修飾顆粒；

4、（3）將雙鍵修飾顆粒、功能單體、致孔劑、交聯(lián)劑及引發(fā)劑混合，其中，功能單體的分子包括末端碳碳雙鍵和順式二羥基兩個特征結(jié)構(gòu)；經(jīng)聚合反應(yīng)，得到表面含有順式二羥基的羥基修飾顆粒；

5、（4）將羥基修飾顆粒與探針試劑的溶液混合，探針試劑的分子結(jié)構(gòu)包括硼酸基團、標(biāo)記反應(yīng)基團、質(zhì)譜增敏基團；經(jīng)孵育使順式二羥基與硼酸基團反應(yīng)形成硼酸酯，得到磁性化學(xué)選擇性探針；

6、（5）將磁性化學(xué)選擇性探針與試劑盒的磁鐵組件聯(lián)用，得到磁性化學(xué)選擇性探針試劑盒。

7、探針中采用四氧化三鐵磁性納米顆粒，具有成本低廉、制備方便、操作便捷、分離高效、物化性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)勢，洗脫后暴露順式二羥基的磁性納米顆粒可以重復(fù)使用。

8、優(yōu)選的，所述步驟（1）的具體操作如下：以四氧化三鐵納米顆粒、四乙氧基硅烷（tetraethoxysilane，teos）為反應(yīng)物，以水、氨水、乙醇為溶液；將反應(yīng)物與溶液混合并進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)完成后經(jīng)純化，獲得表面含有二氧化硅的覆硅顆粒。

9、進(jìn)一步優(yōu)選的，所述氨水、乙醇、水的體積比為1:（5-10）:（20-40）；四氧化三鐵納米顆粒與四乙氧基硅烷的質(zhì)量比范圍為（20-50）:1；溶液與反應(yīng)物的質(zhì)量比為1:（1-3）。

10、優(yōu)選的，所述步驟（1）中，反應(yīng)的溫度為室溫，反應(yīng)的時間為10-14?h。

11、優(yōu)選的，所述步驟（2）的具體操作如下：將覆硅顆粒加至溶劑，混合使其分散均勻，隨后加入甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷進(jìn)行修飾，經(jīng)反應(yīng)形成表面含有碳碳雙鍵的雙鍵修飾顆粒。

12、進(jìn)一步優(yōu)選的，所述覆硅顆粒、甲苯、甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷的質(zhì)量比為（2-4）:1:（2-4）。

13、優(yōu)選的，所述步驟（2）中，反應(yīng)的溫度為室溫，反應(yīng)的時間為20-28?h。

14、優(yōu)選的，所述步驟（3）的具體操作如下：雙鍵修飾顆粒、功能單體、致孔劑、交聯(lián)劑、引發(fā)劑混合，致孔劑采用低沸點溶劑；在一定時間內(nèi)，加熱所得混合物至致孔劑沸騰，該加熱溫度達(dá)到聚合反應(yīng)需求；保持沸騰狀態(tài)，在一定時間內(nèi)將一半用量的致孔劑蒸出；隨后經(jīng)冷卻、回收產(chǎn)物、純化，得到表面含有順式二羥基的羥基修飾顆粒。

15、進(jìn)一步優(yōu)選的，所述雙鍵修飾顆粒、功能單體、交聯(lián)劑的質(zhì)量比為（1-3）:1:（1-3）；引發(fā)劑的添加量為功能單體、交聯(lián)劑、致孔劑總質(zhì)量的0.2?wt.%-5?wt.%。

16、加熱控制為兩步驟進(jìn)行，第一次加熱時間較短，給予一定時間防止爆沸和的致孔劑大量揮發(fā)，第二次加熱則為聚合反應(yīng)及致孔過程提供必要的反應(yīng)時間。

17、進(jìn)一步優(yōu)選的，所述時間依次為10?min-2?h、1-4?h。

18、優(yōu)選的，所述步驟（3）中，功能單體包括3-甲基丙烯酰胺基多巴胺（n-methacryldopamine，mda）、n-(3,4-二羥基丁基)丙烯酰胺、n-(4,5-二羥基戊基)丙烯酰胺中的一種。

19、本領(lǐng)域中，探針試劑的分子設(shè)計通常包含特定的功能基團，例如標(biāo)記反應(yīng)基團和質(zhì)譜增敏基團等，以實現(xiàn)其在分析化學(xué)中的應(yīng)用。標(biāo)記反應(yīng)基團是探針分子中用于與目標(biāo)分析物結(jié)合的部分，它可以是抗體抗原、熒光團、酶標(biāo)記、放射性同位素或穩(wěn)定同位素等，用于提高探針的檢測靈敏度和特異性。質(zhì)譜增敏基團則是用于提高分析物在質(zhì)譜中的離子化效率的結(jié)構(gòu)，這對于提高質(zhì)譜分析的靈敏度和降低檢測限至關(guān)重要。這些基團共同確保了探針在分析化學(xué)中的有效性和靈敏度。例如在本發(fā)明的實施例中，基于分析物所含基團類型而對應(yīng)采用了如對乙胺基苯硼酸、4-羧基苯硼酸、4-(馬來酰亞胺基己酰胺基-n-甲基)苯硼酸作為探針試劑，其中苯環(huán)用于增加標(biāo)記產(chǎn)物的疏水性，增加反相色譜保留；含氮部分為質(zhì)譜增敏基團。標(biāo)記反應(yīng)基團基和質(zhì)譜增敏基團的選擇基于實際應(yīng)用具有靈活性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)分析物類型對應(yīng)選擇合適的類型。

20、優(yōu)選的，所述步驟（4）中，標(biāo)記反應(yīng)基團基于化學(xué)選擇性探針試劑盒的分析物類型選定；分析物含有羧基時，標(biāo)記反應(yīng)基團選擇氨基；分析物含有氨基時，標(biāo)記反應(yīng)基團選擇羧基或琥珀酰亞胺；分析物含有巰基時，標(biāo)記反應(yīng)基團選擇馬來酰亞胺或巰基；分析物含有羰基時，標(biāo)記反應(yīng)基團選擇酰肼或羥胺；分析物含有炔基時，標(biāo)記反應(yīng)基團選擇疊氮。

21、致孔劑通常采用易揮發(fā)的溶劑，其混入聚合物基體后，在材料成型或固化過程中揮發(fā)，從而在材料中留下孔隙。具有良好揮發(fā)性且能夠很好分散與溶解原料的溶劑均可作為制孔劑使用。本發(fā)明中，乙腈是尤其適合的致孔劑選擇。

22、優(yōu)選的，所述步驟（4）中，致孔劑包括水、甲醇、乙腈、環(huán)己烷、甲苯、1,4-丁二醇、十二醇、正丙醇中的至少一種；交聯(lián)劑包括n,n'-亞甲基雙丙烯酰胺（n,n'-methylenebisacrylamide，mba）、乙二醇二甲基丙烯酸酯（ethylene?glycoldimethacrylate，edma）中的一種；引發(fā)劑包括2,2'-偶氮二異丁腈（2,2'-azobis(2-methylpropionitrile)，aibn）、過硫酸銨和過氧苯甲酰中的一種。

23、優(yōu)選的，所述步驟（4）中，孵育溫度為常溫，孵育時間為5?min-4?h。

24、優(yōu)選的，所述步驟（4）中，羥基修飾顆粒、探針試劑的溶液的質(zhì)量比為1:（20-200）；探針試劑的溶液濃度為5?mg/ml。

25、本領(lǐng)域中，溶劑作為促進(jìn)原料分散及營造反應(yīng)適宜條件的介質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本方法涉及的可選原料的理化性質(zhì)，結(jié)合實際條件選擇合適的溶劑類型。在技術(shù)人員知曉上述原則的前提下，溶劑的選擇不具有唯一性，例如甲苯、乙腈等，皆屬于本發(fā)明合適的溶劑類型。

26、在本發(fā)明的第二方面，提供了一種標(biāo)記與釋放迅速、使用成本低廉、具有多種類型分析物標(biāo)記能力的化學(xué)選擇性探針試劑盒，采用本發(fā)明第一方面的制備方法制成。

27、在本發(fā)明的第三方面，提供了一種本發(fā)明第二方面的化學(xué)選擇性探針試劑盒的應(yīng)用，具體為將化學(xué)選擇性探針試劑盒與質(zhì)譜聯(lián)用，用于樣品的檢測與識別。

28、應(yīng)用中，利用硼元素的天然同位素豐度進(jìn)行篩查的快速識別策略，可在沒有穩(wěn)定同位素編碼的技術(shù)情況下快速識別標(biāo)記產(chǎn)物，顯著降低了探針在大規(guī)模樣品分析場景下的使用成本，有助于方法推廣。此外，化學(xué)選擇性標(biāo)記結(jié)合質(zhì)譜的高通量分析方法可以同時研究復(fù)雜樣品中不同類型分析物，獲得準(zhǔn)確和靈敏的定性定量結(jié)果。

29、優(yōu)選的，所述應(yīng)用包括如下步驟：

30、s1、利用溶劑對樣品進(jìn)行提取，得到提取液；

31、s2、取預(yù)定量的提取液加至化學(xué)選擇性探針試劑盒，經(jīng)孵育捕獲樣品中分析物；

32、s3、磁性分離化學(xué)選擇性探針，去除上清液并純化；

33、s4、利用酸性溶液洗脫磁性固定的化學(xué)選擇性探針，釋放標(biāo)記產(chǎn)物，進(jìn)行質(zhì)譜檢測分析；

34、s5、根據(jù)硼元素的天然同位素豐度特征對標(biāo)記產(chǎn)物進(jìn)行篩查。

35、傳統(tǒng)的cp試劑盒的制備和使用過程存在的不足十分明顯。首先，探針制備復(fù)雜，傳統(tǒng)的逐級修飾法的合成步驟可多達(dá)十幾步；而且，cp的標(biāo)記效率不佳，產(chǎn)物釋放條件苛刻且耗時長。強酸堿或強氧化還原反應(yīng)的釋放條件可能會影響產(chǎn)物穩(wěn)定性，溫和的酶或光裂解耗時漫長，尋找合適的裂解位點極為迫切。其次，穩(wěn)定同位素編碼的探針使用成本高，限制了應(yīng)用與推廣。最后，探針覆蓋度與通量不足。面對相互交錯的代謝網(wǎng)絡(luò)，多類型亞代謝組的同時分析非常有必要。為此，本發(fā)明著重改性了cp試劑盒的構(gòu)建策略、簡化了制備步驟、降低了cp試劑盒使用成本，其具有很高的臨床應(yīng)用價值和實用價值。

36、基于以上技術(shù)方案，本發(fā)明的設(shè)計構(gòu)思與原理在于，首先在便于分離的磁性四氧化三鐵納米顆粒表面包覆二氧化硅，隨后采用甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷修飾在表面引入碳碳雙鍵，后續(xù)通過雙鍵聚合與功能單體連接形成連接臂，并結(jié)合致孔劑在顆粒和二氧化硅外層的有機聚合物涂層處形成孔道，該微米級孔道的效果是作為穿透孔提高反應(yīng)動力學(xué)，介孔效果則主要是作為反應(yīng)場所提供限域效應(yīng)。本發(fā)明在常規(guī)的探針試劑分子結(jié)構(gòu)設(shè)計外引入硼酸基團，連接臂中存在的順式二羥基與含有硼酸基團的探針試劑進(jìn)行孵育，通過反應(yīng)形成的硼酸酯基團連接。硼酸基團與順式二羥基結(jié)構(gòu)具有親和性，例如在發(fā)明人的在先申請（cn117147669a）中，發(fā)明人基于該原理設(shè)計了與核苷、糖類、糖蛋白對應(yīng)的功能單體。而在本發(fā)明中，發(fā)明人對硼酸酯基團的利用進(jìn)一步深化，硼酸酯的功能主要分為兩個方面：在化學(xué)選擇性探針中，硼酸酯連接了便于分離的四氧化三鐵納米顆粒部分以及用于捕獲分析物的探針試劑，取樣后探針試劑隨分離完成提??；而在樣品的檢測與識別中，發(fā)明人利用硼酸酯在中性、堿性穩(wěn)定，酸性下易裂解的特性，將其作為裂解位點并于酸性溶液中洗脫，即可便捷地將含有分析物基團地標(biāo)記產(chǎn)物分離并進(jìn)行質(zhì)譜分析。

37、以上設(shè)計和改進(jìn)的效果主要體現(xiàn)在以下方面。本發(fā)明標(biāo)記試劑的密度與已報道的技術(shù)方案相比更高，反應(yīng)的碰撞幾率更高，有利于反應(yīng)；其次，化學(xué)選擇性探針試材料表面的孔狀結(jié)構(gòu)，利用貫穿孔改善反應(yīng)動力學(xué)，介孔提供限域效應(yīng)，由此提升了標(biāo)記效率。而且，磁分離模式簡便高效，允許對多個獨立樣本進(jìn)行同時前處理。面對相互交錯的代謝網(wǎng)絡(luò)、多類型亞代謝組的同時分析，僅需將帶有標(biāo)記反應(yīng)基團的多類化學(xué)選擇性探針試與同一樣本同時進(jìn)行標(biāo)記，即可對多類型的代謝物進(jìn)行同時分析，解決了探針覆蓋度與通量不足的技術(shù)缺陷。

38、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點和有益效果：

39、本發(fā)明提供了一種磁性化學(xué)選擇性探針試劑盒的制備方法，基于硼酸酯反應(yīng)和四氧化三鐵納米顆粒構(gòu)建的磁性化學(xué)選擇性探針可以在溫和的條件下實現(xiàn)探針的便捷制備和標(biāo)記產(chǎn)物的分離，而且不同類型的化學(xué)選擇性探針可以使用相同的四氧化三鐵納米顆粒，僅需簡單更換探針試劑末端的標(biāo)記反應(yīng)基團即可拓展探針的標(biāo)記對象，具有良好的通用性。

40、本發(fā)明提供了一種磁性化學(xué)選擇性探針試劑盒，具有標(biāo)記產(chǎn)物分離與釋放迅速、使用成本低廉、具有多種類型分析物標(biāo)記能力的優(yōu)勢。

41、本發(fā)明提供了一種磁性化學(xué)選擇性探針試劑盒的應(yīng)用，可準(zhǔn)確和靈敏地獲取定性定量結(jié)果，具有易于推廣的優(yōu)勢。