本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)，尤其是涉及一種基于拉曼光譜的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力檢測方法。

背景技術(shù)：

1、腫瘤細(xì)胞獲得高轉(zhuǎn)移能力是腫瘤惡化的重要標(biāo)志之一，對于患者的治療及愈后都是臨床腫瘤研究中面臨的主要難題。對腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，目前實驗室及臨床常用的方法包括以下幾種：1)基于transwell對培養(yǎng)的細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，包括細(xì)胞侵襲、遷移等進(jìn)行比較。該方法需要將細(xì)胞在transwell小室中進(jìn)行培養(yǎng)，然后通過穿過小室底部的細(xì)胞數(shù)量來進(jìn)行比較，因此該方法的主要缺點(diǎn)在于，對組織細(xì)胞或其他不能夠進(jìn)行體外培養(yǎng)的細(xì)胞來說不適用，且細(xì)胞培養(yǎng)需要耗費(fèi)時間，通常要2-3天，因此該方法也較為費(fèi)時；2)基于一些已被文獻(xiàn)報道的與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白表達(dá)情況進(jìn)行判斷。過去對腫瘤轉(zhuǎn)移的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的轉(zhuǎn)移通常會伴隨上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化這一過程(epithelial-mesenchymal?transition,emt)，目前文獻(xiàn)已經(jīng)報道了多種emt相關(guān)蛋白的表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移之間是有關(guān)聯(lián)的，但該方法的缺點(diǎn)在于，現(xiàn)在的研究證明emt是一個復(fù)雜的過程，存在不同的階段，且處于不同階段的腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力表現(xiàn)出顯著的差異，而已報道的這些emt相關(guān)蛋白與復(fù)雜emt過程中腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力之間沒有顯著的相關(guān)性，因此目前尚沒有可靠的emt相關(guān)蛋白可以表征腫瘤的轉(zhuǎn)移能力；3)外周血中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating?tumor?cells，ctc)。腫瘤的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移需要腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血管，隨后通過血液循環(huán)到達(dá)遠(yuǎn)端的靶向器官，隨后出血管，進(jìn)入特定靶向器官，進(jìn)入血管的這部分腫瘤細(xì)胞被稱作ctc，在血液中檢測到ctc代表有腫瘤發(fā)生了轉(zhuǎn)移，該方法的缺點(diǎn)在于，首選需要復(fù)雜的富集方法從血液中對ctc進(jìn)行富集和鑒定，成本較高，且操作復(fù)雜；其次，血液中的ctc含量往往較少，導(dǎo)致是用ctc作為檢測指標(biāo)的靈敏度不夠，容易產(chǎn)生假陰性結(jié)果；4)基于影像學(xué)的診斷。該方法是臨床作為判斷腫瘤是否發(fā)生轉(zhuǎn)移的金標(biāo)準(zhǔn)之一，當(dāng)通過影像學(xué)觀察到在器官中出現(xiàn)腫瘤組織時，可確定已發(fā)生轉(zhuǎn)移。但其缺點(diǎn)也在于，只有已發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移、并且腫瘤細(xì)胞在遠(yuǎn)端器官中定殖、發(fā)育成腫瘤組織后才能通過影像學(xué)觀察到，因此不能實現(xiàn)對腫瘤轉(zhuǎn)移的早期預(yù)測和干預(yù)治療。

2、因此，目前急需一種新的更為簡便、準(zhǔn)確的檢測方法來對腫瘤的轉(zhuǎn)移能力進(jìn)行精準(zhǔn)預(yù)測。

3、有鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的之一在于提供一種基于拉曼光譜的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力檢測方法，以至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。

2、為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：

3、拉曼光譜是一種非標(biāo)記的散射光譜，是分子鍵被激發(fā)到虛能態(tài)卻尚未恢復(fù)到原始態(tài)所引起的入射光被散射后頻率發(fā)生變化的現(xiàn)象，由于不同分子可以產(chǎn)生特定的拉曼散射光譜，因此可以作為區(qū)分不同物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)。最初拉曼光譜主要對化學(xué)物質(zhì)的組成進(jìn)行分析，但隨著技術(shù)的發(fā)展，拉曼光譜技術(shù)逐漸被應(yīng)用于對生物材料，如微生物、血液、細(xì)胞等的鑒定。每個單細(xì)胞的拉曼光譜是由分別對應(yīng)于不同類型化學(xué)鍵的超過1500個拉曼譜峰組成的拉曼譜峰集合(也稱為拉曼組，ramanome)，而這些信號包含了細(xì)胞內(nèi)包括dna、rna、蛋白、脂質(zhì)等所有物質(zhì)的成分及含量等多維信息，能夠反映出細(xì)胞當(dāng)下的生命特征。由于拉曼光譜技術(shù)可以在單細(xì)胞水平實現(xiàn)檢測，且對于細(xì)胞的檢測時間只需要1秒左右，因此被逐漸應(yīng)用于生物領(lǐng)域。在腫瘤研究領(lǐng)域，已有報道通過基于腫瘤拉曼光譜對不同類型腫瘤細(xì)胞、藥物誘導(dǎo)前后的腫瘤等進(jìn)行區(qū)分，以及對腫瘤組織直接進(jìn)行拉曼檢測用于區(qū)分不同類型腫瘤等的研究。這些已有的研究證明，無論是對于不同類型的腫瘤細(xì)胞，還是在藥物誘導(dǎo)下發(fā)生emt的同種細(xì)胞，基于拉曼光譜均可以實現(xiàn)有效的區(qū)分，尤其在皮膚癌中，處于表皮的腫瘤組織和已侵入真皮的腫瘤組織在拉曼光譜檢測下也能實現(xiàn)區(qū)分，但對于腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力與其拉曼信號之間的關(guān)聯(lián)，還鮮有報道?；诖?，第一方面，本發(fā)明提供了一種基于拉曼光譜的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力檢測方法，包括如下步驟：

4、a)對具有不同轉(zhuǎn)移能力的腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行單細(xì)胞拉曼光譜檢測；

5、b)使用機(jī)器學(xué)習(xí)算法，構(gòu)建基于單細(xì)胞拉曼信號數(shù)據(jù)的可用于區(qū)分不同轉(zhuǎn)移能力的不同細(xì)胞系的分類模型；

6、c)利用gini算法從所述分類模型中篩選出對分類權(quán)重高的拉曼信號峰；

7、d)根據(jù)所述拉曼信號峰與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的相關(guān)性及其拉曼信號強(qiáng)度，計算得到拉曼轉(zhuǎn)移指數(shù)rmi。

8、與transwell方法相比，本發(fā)明提供的檢測方法可應(yīng)用于組織細(xì)胞及其他無法體外培養(yǎng)的細(xì)胞，且每個細(xì)胞檢測只需要幾秒鐘，更加省時省力，且由于是在單細(xì)胞水平進(jìn)行檢測，所需的細(xì)胞量更少，還可以反映出腫瘤的異質(zhì)性；與ctc細(xì)胞檢測相比，本發(fā)明提供的檢測方法無需過多的前處理步驟，且是對原位腫瘤細(xì)胞進(jìn)行檢測，更容易獲得樣本，ctc在血液中含量極低，且需要較為復(fù)雜的富集過程；與金標(biāo)準(zhǔn)影像學(xué)相比，本發(fā)明提供的檢測方法可以在尚未形成遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移灶之前，即可通過對原位腫瘤的檢測，判斷出其是否有較大轉(zhuǎn)移的風(fēng)險，從而提前干預(yù)。

9、進(jìn)一步地，步驟a)中，所述具有不同轉(zhuǎn)移能力的腫瘤細(xì)胞系包括具有高轉(zhuǎn)移能力的aspc1細(xì)胞系、具有中轉(zhuǎn)移能力的panc1和bxpc3細(xì)胞系以及具有低轉(zhuǎn)移能力的miapaca2細(xì)胞系。

10、可以理解的是，本發(fā)明對具有不同轉(zhuǎn)移能力的腫瘤細(xì)胞系的具體選擇不做限定，也可選用其他已知轉(zhuǎn)移能力有差異的腫瘤細(xì)胞作為標(biāo)準(zhǔn)。

11、以上述四株已被驗證過腫瘤轉(zhuǎn)移能力的腫瘤細(xì)胞作為標(biāo)準(zhǔn)，得到的拉曼轉(zhuǎn)移指數(shù)rmi準(zhǔn)確性更高。

12、進(jìn)一步地，步驟a)中，所述拉曼光譜檢測的激光功率為100mw，波長為532nm，采集時間為1秒。

13、進(jìn)一步地，步驟b)中，所述的機(jī)器學(xué)習(xí)算法包括隨機(jī)森林算法。

14、可以理解的是，本發(fā)明對機(jī)器學(xué)習(xí)算法的具體類型不做限定，也可使用除隨機(jī)森林外的其他算法進(jìn)行建模，例如pc-lda(線性主成分分析)或svm(支持向量機(jī))等。

15、進(jìn)一步地，步驟c)中，利用gini算法的篩選條件為gini分?jǐn)?shù)大于0.75。

16、gini分?jǐn)?shù)越高，代表其對應(yīng)的拉曼特征峰在區(qū)分腫瘤轉(zhuǎn)移能力中的作用越高，即其與腫瘤轉(zhuǎn)移之間的關(guān)聯(lián)性越強(qiáng)。因此gini分?jǐn)?shù)越高，所得到的拉曼峰對rmi的計算越準(zhǔn)確。但gini分?jǐn)?shù)越高，拉曼特征峰的數(shù)量越少，在兼顧拉曼峰對于rmi的計算準(zhǔn)確性時，還要考慮拉曼特征峰的多樣性，防止出現(xiàn)過擬合的現(xiàn)象，從而降低了應(yīng)用范圍，因此在多種嘗試后，以0.75為篩選條件最為合適。

17、進(jìn)一步地，步驟c)中，所述對分類權(quán)重高的拉曼信號峰包括1465cm-1、1129cm-1、1435cm-1、854cm-1、1433cm-1、1699cm-1、1078cm-1、1302cm-1、1449cm-1、1461cm-1、1559cm-1、1352cm-1、1065cm-1、1668cm-1和1799cm-1。

18、除上述列舉的拉曼信號峰外，也可選用除這15個拉曼信號峰之外的，或者包含這15個拉曼峰中一部分，同時加入其他新的拉曼峰的方法用于計算rmi。

19、進(jìn)一步地，所述腫瘤細(xì)胞包括胰腺癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞和脈絡(luò)膜黑色素瘤細(xì)胞。

20、進(jìn)一步地，所述腫瘤細(xì)胞包括自然細(xì)胞、經(jīng)基因編輯的細(xì)胞和經(jīng)藥物處理的細(xì)胞。

21、發(fā)明人通過體內(nèi)、體外實驗對rmi的效果進(jìn)行了驗證，證明其對于體內(nèi)、體外細(xì)胞，以及不同類型的腫瘤細(xì)胞系，包括胰腺癌細(xì)胞系(aspc1，p1e6，p1g8，p2d6，p2g8)，宮頸癌細(xì)胞系(siha)和脈絡(luò)膜黑色素瘤細(xì)胞系(mum2b)都可以有效的表征其轉(zhuǎn)移能力，此外，本方法還發(fā)現(xiàn)，無論是對于通過基因編輯的方法使得腫瘤轉(zhuǎn)移能力產(chǎn)生差別，如aspc1-ko和-nc，siha-oe和-nc，還是通過藥物處理導(dǎo)致的轉(zhuǎn)移能力有差別，如mum2b-art和-nc(art代表青蒿琥脂處理)，以及沒有任何處理的自然細(xì)胞(p1g8、p1e6、p2g8、p2d6)，都可以對其轉(zhuǎn)移能力實現(xiàn)準(zhǔn)確的指征，說明本方法不受腫瘤類別的影響，具有更好的實用性。

22、進(jìn)一步地，所述拉曼轉(zhuǎn)移指數(shù)rmi為ramanome-based?metastasis?index的縮寫，即基于單細(xì)胞拉曼信號所計算的用于表征腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的系數(shù)，其計算方法為如下公式，其中w為權(quán)利6中各拉曼峰在細(xì)胞中的真實拉曼信號，i為各拉曼峰與腫瘤轉(zhuǎn)移能力之間的關(guān)聯(lián)性，正相關(guān)則i值為1，負(fù)相關(guān)則為-1。

23、rm＝w(1)。

24、進(jìn)一步地，只需要通過單細(xì)胞拉曼儀對培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行簡單、快速的拉曼信號檢測，隨后通過構(gòu)建的rmi算法，基于15個拉曼特征峰的信號強(qiáng)度及其與腫瘤轉(zhuǎn)移之間的關(guān)聯(lián)性，即可計算出其rmi值，而rmi值得大小則代表了腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力的大小，rmi值越大，腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力越強(qiáng)，從而實現(xiàn)對腫瘤轉(zhuǎn)移能力快速、準(zhǔn)確的預(yù)測。

25、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

26、本發(fā)明將單細(xì)胞拉曼技術(shù)與機(jī)器學(xué)習(xí)的方法相結(jié)合，根據(jù)腫瘤細(xì)胞的拉曼信號來快速、準(zhǔn)確的預(yù)測腫瘤的轉(zhuǎn)移能力，其優(yōu)點(diǎn)在于：1)相較于transwell，本方法可實現(xiàn)對細(xì)胞來源沒有限制，培養(yǎng)細(xì)胞或組織來源的細(xì)胞均可以檢測，擴(kuò)展了檢測的使用場景，且本方法操作簡單，對細(xì)胞不需要過多處理，可直接利用單細(xì)胞拉曼儀進(jìn)行檢測，且單個細(xì)胞只需要5s就可以檢測完成，更為高效；2)相較于emt相關(guān)蛋白，本方法是對細(xì)胞的整體拉曼信號進(jìn)行分析，而不是單純的幾個蛋白，因此能更加準(zhǔn)確的反映細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，結(jié)果也更為準(zhǔn)確；3)相比于ctc，本方法可實現(xiàn)在單細(xì)胞水平的鑒定，因此靈敏度高于ctc，且本方法可以直接通過對原位組織的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行檢測，并通過計算的rmi值使腫瘤的轉(zhuǎn)移能力被量化，從而更早的預(yù)測其是否會發(fā)生轉(zhuǎn)移；4)相比于影像學(xué)方法，本方法可以提前對未發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤組織進(jìn)行其轉(zhuǎn)移能力的預(yù)測，對那些具有高轉(zhuǎn)移潛力的腫瘤提前進(jìn)行干預(yù)治療，提高治愈率。