本發(fā)明屬于生物檢測，具體涉及一種抗淬滅熒光染色劑及其制備方法與應用。

背景技術：

1、真菌是一類微生物，包括酵母菌和霉菌。真菌感染通常發(fā)生在皮膚、指甲、頭發(fā)和黏膜等部位。常見的真菌感染包括白色念珠菌感染(口腔念珠菌感染、陰道念珠菌感染)、足癬、指甲真菌感染等。一些真菌感染可能需要藥物治療，嚴重感染可能需要系統(tǒng)性抗真菌藥物。

2、在真菌感染的診斷和治療過程中，準確快速地檢測活性真菌至關重要。一些常見的真菌檢測技術手段有培養(yǎng)分離技術、分子生物學方法、熒光染色、質(zhì)譜技術、免疫學方法、快速檢測技術等。

3、熒光檢測法是一種已有較多應用的快速檢測真菌方法。傳統(tǒng)的染色方法存在著染色過程耗時、染色效果不穩(wěn)定、漏檢率高、染色劑穩(wěn)定性差、熒光淬滅等問題，因此需要開發(fā)一種提高真菌檢測的準確性和穩(wěn)定性的新方法。

4、量子點標記技術是一種用于生物醫(yī)學領域的先進成像技術，它利用納米級的半導體材料量子點作為熒光標記物，來標記生物分子或細胞結(jié)構(gòu)，以實現(xiàn)高靈敏度和高分辨率的成像。

技術實現(xiàn)思路

1、發(fā)明目的：本發(fā)明目的在于提供一種抗淬滅熒光染色劑及其制備方法與應用。本發(fā)明抗淬滅熒光染色劑能夠用于活真菌檢測，能夠?qū)哂兄虏⌒缘恼婢鷮崿F(xiàn)無淬滅熒光鏡下染色觀察。本發(fā)明將伴刀豆球蛋白a和小麥胚芽凝集素的特異性和量子點的穩(wěn)定性結(jié)合，以確保對真菌感染活躍階段的準確判斷。本發(fā)明為活真菌的檢測提供了高效、穩(wěn)定且準確的方法，可廣泛應用于真菌研究，并具有潛在的臨床應用前景。

2、技術方案：本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現(xiàn)：

3、本發(fā)明提供了一種抗淬滅熒光染色劑，所述染色劑中至少包含伴刀豆球蛋白a、小麥胚芽凝集素、量子點和抗淬滅劑；

4、所述伴刀豆球蛋白a在染色劑中的占比為0.1-1mg/100ml；

5、所述小麥胚芽凝集素在染色劑中的占比為0.1-1mg/100ml；

6、所述量子點在染色劑中的占比為0.1-0.5mg/100ml；

7、所述抗淬滅劑在染色劑中的占比為80-180mg/100ml。

8、所述伴刀豆球蛋白a與真菌細胞壁中的a-吡喃甘露糖基和a-吡喃葡萄糖基殘基結(jié)合。所述小麥胚芽凝集素對唾液酸和n-乙酰葡糖胺具有高親和力，可與出芽真菌結(jié)合。

9、本發(fā)明伴刀豆球蛋白a能夠與酵母和真菌細胞壁中的糖基殘基特異性結(jié)合，小麥胚芽凝集素可以實現(xiàn)對活性出芽真菌染色，通過將量子點標記伴刀豆球蛋白a和小麥胚芽凝集素，實現(xiàn)對活性真菌的檢測。

10、半導體量子點材料通常為ii-vi族或iii-v族的二元或三元半導體化合物。本發(fā)明量子點可選擇常見的量子點材料，如znte、cdse、cds、cdte等，還可以選擇帶外殼或者經(jīng)過修飾的量子點，如cdse/zns量子點、cdse/zns/sio2量子點等，對發(fā)光顏色以及激發(fā)波長進行選擇。

11、本發(fā)明將量子點材料應用于臨床感染性真菌檢測，相比于現(xiàn)有的熒光染色、革蘭氏染色和“白片”，具有無淬滅、易觀察診斷的特點。

12、優(yōu)選地，所述量子點選自znte量子點、cdse量子點、巰基乙酸修飾的znte量子點或巰基乙酸修飾的cdse量子點。

13、進一步優(yōu)選地，所述量子點選自巰基乙酸修飾的znte量子點(激發(fā)波長365nm，發(fā)射波長425nm)或巰基乙酸修飾的cdse量子點(激發(fā)波長365nm，發(fā)射波長620nm)。znte和cdse量子點具有優(yōu)異的熒光量子產(chǎn)率、較窄的發(fā)射帶寬，熒光性能優(yōu)異；365nm的激發(fā)波長最為常見，易于獲得，增加了本發(fā)明的適用性。本發(fā)明選擇的量子點，發(fā)光持續(xù)時間長且無熒光淬滅現(xiàn)象。

14、優(yōu)選地，所述抗淬滅劑為p-苯二胺(para-phenylene?diamine，ppd)、n-丙基沒食子酸鹽(propyl?gallate，npg)、1，4-二偶氮雙環(huán)[2，2，2)-辛烷(1，4diazobicyelo(2，2，2)-octane，dabco)中的一種或幾種。

15、本發(fā)明一種優(yōu)選地實施方式是，所述染色劑中還可以包含抑菌劑、有機促溶劑、保濕劑或穩(wěn)定劑中的一種或多種。利用量子點抗淬滅特性以及添加抗淬滅保護劑和背景消除劑，實現(xiàn)對活性真菌感染的長時間穩(wěn)定檢驗。

16、進一步地，所述抑菌劑為硫柳汞、疊氮鈉或proclin?300中的一種或幾種。硫柳汞對革蘭陽性和陰性菌均有很強的抑菌能力，為廣譜抑菌劑。疊氮鈉是體外診斷試劑中最常用的防腐劑之一。proclin?300活性具有廣譜適用性。所述抑菌劑在染色劑中的占比為0.05-1g/100ml。

17、進一步地，所述有機促溶劑為甘油，其在染色劑中的占比為2-10ml/100ml。甘油是一種極性有機溶劑，能夠很好地溶解和分散目標化合物，從而提高其在水溶液中的溶解度和生物利用度。這對于真菌抗淬滅熒光染色劑的應用很重要。同時，甘油是一種相對安全、無毒的有機化合物，在生物學應用中廣泛使用。與其他一些有機溶劑相比，甘油對生物體系的影響較小，有利于提高該染色劑的生物相容性。甘油具有良好的化學穩(wěn)定性，能夠保護目標化合物免受環(huán)境因素如氧化、水解等的破壞，從而提高染色劑的穩(wěn)定性和使用壽命。此外，甘油也可以發(fā)揮保濕劑的作用。

18、本發(fā)明所述保濕劑可以選自二甲基亞砜、甘油、丙二醇、山梨醇或聚乙二醇(peg)。其中，甘油作為一種多羥基醇，具有優(yōu)良的保濕性能，能夠吸附和保持水分，提高染色劑的濕潤性和穩(wěn)定性。丙二醇也是一種常見的保濕劑，具有良好的溶解性和滲透性，可以增強染色劑的濕潤性和滲透性。山梨醇是一種多元醇類保濕劑，具有較強的吸濕性和保濕能力，有助于維持染色劑的濕潤狀態(tài)。不同分子量的peg可以作為保濕劑，具有良好的親水性和保濕性。

19、進一步地，所述保濕劑為二甲基亞砜(dmso)。二甲基亞砜為無色液體，無臭或幾乎無臭，有引濕性，被稱為萬能溶媒。dmso具有一定的吸濕性，能夠從環(huán)境中吸收水分子，增加自身的含水量。dmso分子小，具有良好的滲透性，能夠滲透進入皮膚或其他表面，攜帶水分子。dmso能夠在皮膚或表面形成一層保護膜，阻隔水分的蒸發(fā)，從而保持表面的濕潤狀態(tài)。dmso分子具有一定的親和性，能夠與水分子形成氫鍵結(jié)合，增強對水分子的保持能力。因此，dmso可以作為一種有效的保濕劑使用，在保持表面濕潤、防止水分蒸發(fā)等方面發(fā)揮作用。所述保濕劑在染色劑中的占比為10-20ml/100ml。

20、本發(fā)明所述穩(wěn)定劑可以選自山梨醇、其它糖類穩(wěn)定劑(如蔗糖和甘油)、表面活性劑(如吐溫-20、sds)。

21、進一步地，所述穩(wěn)定劑為山梨醇。山梨醇是一種常見的糖類穩(wěn)定劑，在生物技術領域應用廣泛，具有成熟的使用經(jīng)驗。山梨醇具有良好的溶解性和兼容性，不會對敏感的熒光染料或酶產(chǎn)生干擾。山梨醇可以提高溶液的粘度和保濕性，減少試劑的蒸發(fā)和降解。山梨醇與其他成分協(xié)同作用，可以提高整體配方的穩(wěn)定性和保存期。所述穩(wěn)定劑在染色劑中的占比為3-20mg/100ml。

22、本發(fā)明還提供了所述的抗淬滅熒光染色劑的制備方法，包括以下步驟：

23、(1)稱取伴刀豆球蛋白a和小麥胚芽凝集素加入水中，置于4℃充分混勻，調(diào)節(jié)溶液ph＝8.0±0.2；

24、(2)稱取量子點加入至步驟(1)所得溶液中，充分攪拌均勻，置于4℃過夜反應；

25、(3)稱取抗淬滅劑、抑菌劑、有機促溶劑、保濕劑、穩(wěn)定劑加入步驟(2)所得溶液中，加水，定容，即得所述抗淬滅熒光染色劑，避光、4℃保存。

26、優(yōu)選地，步驟(1)中，使用0.1m氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液至ph＝8.0±0.2。

27、本發(fā)明還提供了所述的抗淬滅熒光染色劑在活真菌檢測中的應用。

28、使用所述抗淬滅熒光染色劑的檢測方法，包括以下步驟：

29、(1)取檢測樣本置于載玻片中間觀察區(qū)域；

30、(2)滴加適量所述抗淬滅熒光染色劑至完全浸沒樣本，蓋上蓋玻片，使用紫外手電筒或在熒光顯微鏡下365nm激發(fā)光觀察。

31、本發(fā)明檢測方法可全部使用uv波段進行觀察。

32、有益效果：

33、1、本發(fā)明添加了伴刀豆球蛋白a和小麥胚芽凝集素，可以特異性結(jié)合在真菌表面，及時排除細菌及異常細胞，提高檢測的準確性。

34、2、本發(fā)明添加了量子點標記，相比于傳統(tǒng)的有機熒光素，量子點僅需要單一的激發(fā)波長即可實現(xiàn)一個或多個波段檢測，且無熒光淬滅，持續(xù)時間長，提高了檢測的穩(wěn)定性。

35、3、本發(fā)明采用一步法染色，操作簡便，操作時間短，可快速觀察檢測結(jié)果，不耽誤患者的病情及治療用藥。

36、4、本發(fā)明所述的抗淬滅熒光染色劑相比于傳統(tǒng)的真菌診斷和檢驗方法，其優(yōu)勢在于：

37、(1)利用凝集素的特性，確保染色的真菌處于感染活躍階段，可篩選強致病性真菌樣本；

38、(2)利用量子點作為顯色基團，觀測的波長更加寬泛，且熒光淬滅低，顯色時間長，保證了臨床診斷的時間，解決了臨床中熒光持續(xù)時間短造成的漏檢、難檢的問題，為臨床活真菌感染診斷提供了一種高效、穩(wěn)定且準確的方法。