本發(fā)明屬于生物醫(yī)學光學成像，具體涉及一種基于組織光透明的快速三維成像方法。

背景技術(shù)：

1、常規(guī)的組織病理檢測包括固定、脫水、石蠟包埋、切片、染色、成像等步驟。經(jīng)由穿刺活檢或手術(shù)切除獲得的樣本將被浸泡在甲醛等組織固定劑中，以凝固蛋白質(zhì)、防止核酸降解。隨后，組織將在梯度乙醇中完全脫水，從而使得石蠟能充分的浸入并包埋樣本。石蠟包埋能夠為樣本提供足夠的剛性，從而避免了切片過程中樣本的破損或形變。被切割為4-5μm厚的組織將被染色劑（如h&e、masson等）染色，以區(qū)分組織中的不同結(jié)構(gòu)。處理完畢的樣本將在顯微鏡下進行組織學檢測，通過觀察組織中細胞的形態(tài)或類型，對疾病進行診斷。

2、然而，現(xiàn)有的常規(guī)組織病理檢測方法也存在一定的問題。首先，常規(guī)組織病理檢測的處理時間較長，整個樣本的處理流程通常需要一周左右的時間。這可能導致診斷結(jié)果相較于實際病情的滯后，并在一定程度上延誤疾病的治療時機。同時，復雜、繁多的操作步驟也使得組織病理檢測成為一個勞動密集型過程，需要消耗大量人力制備樣本。在病理檢測中，僅會從組織中提取幾十張4-5μm厚的薄切片，用于診斷分析。而相較于原先毫米厚度的組織，僅有不足5%的樣本將會被染色以及可視化，從而導致大量信息的丟失。一些在組織中較為稀疏的結(jié)構(gòu)，如腫瘤祖細胞、治療后殘余的病灶等結(jié)構(gòu)，均可能在切片過程中被遺漏，最終導致這些重要的病理指標在常規(guī)組織病理檢測中難以被有效識別和量化分析。同時，常規(guī)的組織病理檢測流程包含樣本的破壞性切片，使得樣本無法被反復利用，導致分子檢測等需要大量組織樣本的后續(xù)的分析難以進行。

3、難以獲得病理組織的三維結(jié)構(gòu)也是常規(guī)病理檢測的一個重要問題。生物組織中包含血管網(wǎng)絡(luò)、腺體網(wǎng)絡(luò)等復雜的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，且疾病的發(fā)生發(fā)展往往會導致這些三維結(jié)構(gòu)被破壞或發(fā)生變形。因而將病理組織樣本中的三維結(jié)構(gòu)進行有效的重建與分析在疾病的診斷中具有相當關(guān)鍵的作用。但在常規(guī)組織病理檢測中，僅能獲得組織切片的二維圖像，而缺乏組織的三維信息，通過這些有限的二維圖像去分析樣本實際的三維結(jié)構(gòu)，可能會產(chǎn)生錯誤的判斷。例如健康的腺體結(jié)構(gòu)，可能會由于切面選取的原因，在二維圖像中反映為發(fā)育不良的結(jié)構(gòu)。同時，二維圖像也難以反映細胞與細胞、細胞與微環(huán)境之間的空間位置關(guān)系及相互作用。這些問題限制了組織病理檢測在診斷疾病上的應(yīng)用。

4、近幾十年來光學成像技術(shù)發(fā)展迅速，出現(xiàn)了包括雙光子顯微鏡、共聚焦顯微鏡以及光片顯微鏡等一系列具有光學層析能力的顯微成像技術(shù)。這些方法允許對樣本特定深度的信號進行激發(fā)與成像，從而獲取樣本的三維信息。然而，由于生物組織的對光的高散射與高吸收，使得光學成像方法的成像深度受到顯著限制，通常僅能對幾十到幾百微米深度的組織進行成像。

5、因此，有必要提供一種基于組織光透明的快速三維成像方法來解決現(xiàn)有的對組織樣本進行三維成像的不足。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種基于組織光透明的快速三維成像方法。本發(fā)明中通過對組織進行染色、透明、成像和三維重建與分析后，能獲取組織的完整三維信息，結(jié)果穩(wěn)定可靠，并且整個方法快速、簡單，因此，在組織病理檢測中具有較好的應(yīng)用前景。

2、在第一方面，本發(fā)明提供了一種基于組織光透明的快速三維成像方法，包括如下步驟：將生物組織樣本置于染色液中，經(jīng)振蕩處理后，得到染色后的組織樣本；將染色后的組織樣本依次置于脫水液、脫脂液和折射率匹配液中進行振蕩處理，得到透明化的組織樣本；將透明化的組織樣本進行三維成像，得到組織樣本的三維熒光圖；對組織樣本的三維熒光圖進行轉(zhuǎn)換，將所得染色明場圖像進行三維重建，得到組織樣本的三維染色圖。

3、本發(fā)明中，發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，在對生物組織樣本進行染色的步驟中，通過向染色液中加入無機鹽和醇類物質(zhì)，能夠有效地提高生物組織樣本的染色深度與染色速度，實現(xiàn)樣本穩(wěn)定、均勻的染色；在對染色后的組織樣本進行透明化的步驟中，通過化學脫水代替?zhèn)鹘y(tǒng)的物理梯度脫水，在大幅提高透明化速度的同時，降低了透明處理的復雜度，同時顯著提高透明效果；進一步地，通過將透明化的組織樣本進行三維成像、經(jīng)轉(zhuǎn)換和三維重建，得到組織樣本的三維染色圖，該三維染色圖能有效、準確地反映樣本的三維結(jié)構(gòu)信息，結(jié)果穩(wěn)定可靠，并且整個方法快速、簡單。

4、在一些實施方案中，生物組織樣本包括哺乳動物組織器官。

5、在一些更優(yōu)選的實施方案中，哺乳動物包括人、獼猴、小鼠、大鼠、兔子、魚類和昆蟲。

6、需要說明的是，本發(fā)明中的組織光透明試劑能對現(xiàn)有常規(guī)的生物組織進行快速透明化，包括但不限于人、獼猴、小鼠、大鼠、兔子、魚類和昆蟲。

7、在一些實施方案中，在染色后的組織樣本的制備過程中，染色液包括1-10nm（例如可以為1nm、3nm、5nm、7nm、10nm或該范圍內(nèi)的其他數(shù)值）的細胞核染色劑、10-100nm（例如可以為10nm、30nm、50nm、70nm、100nm或該范圍內(nèi)的其他數(shù)值）的細胞質(zhì)染色劑、10-100mm（例如可以為10mm、30mm、50mm、70mm、100mm或該范圍內(nèi)的其他數(shù)值）的無機鹽和10-70wt%（例如可以為10wt%、30wt%、50wt%、70wt%或該范圍內(nèi)的其他數(shù)值）的醇類物質(zhì)，其余為蒸餾水；振蕩處理步驟具體包括：在溫度為20-25℃（例如可以為20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃或該范圍內(nèi)的其他數(shù)值）的條件下，振蕩6-48h，例如可以為6h、10h、20h、30h、40h、48h或該范圍內(nèi)的其他數(shù)值。

8、在一些實施方案中，細胞核染色劑選自to-pro-3、dapi和pi中的至少一種；細胞質(zhì)染色劑選自伊紅、cy3和nhs酯中的至少一種；無機鹽選自氯化鈉、磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉中的至少一種；醇類物質(zhì)選自甲醇、乙醇和丙三醇中的至少一種。

9、在一些實施方案中，在透明化的組織樣本的制備過程中，脫水液包括5-30wt%（例如可以為5wt%、10wt%、15wt%、20wt%、25wt%、30wt%或該范圍內(nèi)的其他數(shù)值）的多元醇、5-30wt%（例如可以為5wt%、10wt%、15wt%、20wt%、25wt%、30wt%或該范圍內(nèi)的其他數(shù)值）的氨基醇和0.1-1wt%（例如可以為0.1wt%、0.3wt%、0.5wt%、0.7wt%、1wt%或該范圍內(nèi)的其他數(shù)值）的還原劑，其余為脫水劑；并且脫水劑選自硼酸三(4-氯苯)酯、硼酸三苯酯、硼酸三甲酯和硼酸三丁酯中的至少一種；在將染色后的組織樣本置于脫水液中進行振蕩處理步驟具體包括：在溫度為30-40℃（例如可以為30℃、32℃、35℃、38℃、40℃或該范圍內(nèi)的其他數(shù)值）的條件下，振蕩20-180min，例如可以為20min、50min、80min、110min、140min、180min或該范圍內(nèi)的其他數(shù)值。

10、在一些實施方案中，多元醇選自丙二醇、丙三醇、戊二醇和己二醇中的至少一種；氨基醇選自三乙醇胺、n-甲基二乙醇胺和n-丁基二乙醇胺中的至少一種；還原劑選自硫代甘油、維生素d和維生素c中的至少一種。

11、在一些實施方案中，在透明化的組織樣本的制備過程中，脫脂液包括0.1-1wt%（例如可以為0.1wt%、0.3wt%、0.5wt%、0.7wt%、1wt%或該范圍內(nèi)的其他數(shù)值）的還原劑，其余為脫脂劑；并且脫脂劑選自環(huán)己烷、乙醇、二氯甲烷和苯甲酸芐酯中的至少一種；在將經(jīng)脫水液處理的組織樣本置于脫脂液中進行振蕩處理步驟具體包括：在溫度為30-40℃（例如可以為30℃、32℃、35℃、38℃、40℃或該范圍內(nèi)的其他數(shù)值）的條件下，振蕩10-60min，例如可以為10min、20min、30min、40min、50min、60min或該范圍內(nèi)的其他數(shù)值。

12、在一些實施方案中，還原劑選自硫代甘油、維生素d和維生素c中的至少一種。

13、在一些實施方案中，在透明化的組織樣本的制備過程中，折射率匹配液包括二芐醚、苯甲酸芐酯、苯甲醇和肉桂酸乙酯中的至少一種；在將經(jīng)脫脂液處理的組織樣本置于折射率匹配液中進行振蕩處理步驟具體包括：在溫度為30-40℃（例如可以為30℃、32℃、35℃、38℃、40℃或該范圍內(nèi)的其他數(shù)值）的條件下，振蕩5-60min，例如可以為5min、10min、20min、30min、40min、50min、60min或該范圍內(nèi)的其他數(shù)值。

14、在一些實施方案中，在組織樣本的三維熒光圖成像過程中，三維成像步驟具體包括：使用熒光顯微鏡對透明化的組織樣本進行三維成像；其中，熒光顯微鏡包括共聚焦顯微鏡和/或光片顯微鏡。

15、在一些優(yōu)選的實施方案中，使用共聚焦顯微鏡對透明化的組織樣本進行三維成像步驟具體包括：使用蓋玻片夾持樣本，加入折射率匹配液充分浸潤；使用5x倍或10x倍鏡獲取樣本的整體分布特征后，繼續(xù)使用20x倍鏡獲取樣本精細結(jié)構(gòu)，并使用alexa?fluor?555通道及alexa?fluor?647通道分別對樣本中的細胞質(zhì)與細胞核信號進行激發(fā)，對樣本進行三維成像。

16、在一些優(yōu)選的實施方案中，使用光片顯微鏡對透明化的組織樣本進行三維成像步驟具體包括：使用玻璃制的夾子夾持樣本，并浸入裝有折射率匹配液的成像槽中；使用4x倍鏡對樣本進行粗掃，調(diào)整掃描起始點與終止點的位置，確保樣本被掃描完全，并使用alexafluor?555通道及alexa?fluor?647通道分別對樣本中的細胞質(zhì)與細胞核信號進行激發(fā)，在粗掃完成后，將鏡片更換為25x倍鏡對樣本的精細結(jié)構(gòu)進行三維成像。

17、在一些實施方案中，在組織樣本的三維染色圖重建過程中，轉(zhuǎn)換步驟具體包括：將組織樣本的三維熒光圖轉(zhuǎn)換為tif格式，經(jīng)色彩通道轉(zhuǎn)換軟件轉(zhuǎn)換后，得到染色明場圖像；三維重建步驟具體包括：使用imaris軟件進行三維重建。

18、在一些優(yōu)選的實施方案中，色彩通道轉(zhuǎn)換軟件包括falsecolor。

19、本發(fā)明的有益效果是：區(qū)別于現(xiàn)有技術(shù)的情況，本發(fā)明提供一種基于組織光透明的快速三維成像方法，具體地，通過對生物組織樣本依次進行染色、透明化、成像和三維重建與分析等步驟后，能獲取生物組織樣本的完整三維結(jié)構(gòu)信息，結(jié)果穩(wěn)定可靠，并且整個方法快速、簡單，因此，該快速三維成像方法在組織病理檢測中具有較好的應(yīng)用前景。