本發(fā)明屬于微流控檢測(cè)芯片，涉及一種無生物酶型肌酐檢測(cè)微流控檢測(cè)芯片，特別涉及一種用于汗液中肌酐檢測(cè)的可穿戴微流控比色檢測(cè)芯片及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、汗液由汗腺分泌，富含電解質(zhì)(na+、k+、ca2+等)和代謝分子(葡萄糖、乳酸、肌酐等)，可用于在分子水平上指示身體的健康狀況，為了解個(gè)人健康狀況提供重要依據(jù)，對(duì)于各種疾病的早期發(fā)現(xiàn)、監(jiān)測(cè)和治療具有重要意義。汗液可通過非侵入性、連續(xù)的方式，在幾乎全身皮膚表面實(shí)現(xiàn)高重現(xiàn)、原位采集，是理想的人體液檢測(cè)樣本。因此，近年來汗液檢測(cè)技術(shù)得到迅速發(fā)展，并形成了一個(gè)集分析、傳感、醫(yī)療健康等多學(xué)科交叉的熱點(diǎn)領(lǐng)域。然而，傳統(tǒng)的汗液檢測(cè)是在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，往往需要復(fù)雜的設(shè)備和繁瑣的步驟，這極大影響了檢測(cè)的便攜性和實(shí)時(shí)性。

2、近年來，隨著微加工技術(shù)和柔性材料的發(fā)展，可穿戴微流控芯片開始被用于人體汗液檢測(cè)。與傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)相比，可穿戴微流控檢測(cè)芯片將傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行的樣品運(yùn)輸、分離、反應(yīng)、分析等功能集成到一塊幾平方厘米的微小芯片上，具有體積小、成本低、響應(yīng)迅速、連續(xù)采集、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)。

3、肌酐是肌肉產(chǎn)生能量過程中產(chǎn)生的一種化合物，人體中的肌酐水平反映了腎臟的過濾功能，是檢測(cè)腎臟功能的重要指標(biāo)。檢測(cè)肌酐的方法有多種，包括色譜法、質(zhì)譜法、電化學(xué)法和毛細(xì)管區(qū)帶電泳法等，這些方法需要專業(yè)人員操作專業(yè)檢測(cè)儀器，只能在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。比色法具有簡(jiǎn)單、低成本、快速等優(yōu)點(diǎn)，在便攜式檢測(cè)領(lǐng)域具有重要應(yīng)用前景。jaffe法是傳統(tǒng)的肌酐檢測(cè)比色方法，但是jaffe法因特異性差和易受多種物質(zhì)干擾的缺點(diǎn)，使得該方法在實(shí)際應(yīng)用中存在一定的局限性。

4、目前所開發(fā)的應(yīng)用于肌酐檢測(cè)的微流控比色檢測(cè)芯片，多需使用肌酐氧化酶，催化肌酐逐漸水解為過氧化氫，生成的過氧化氫進(jìn)一步與顯色試劑反應(yīng)，生成用于定量檢測(cè)的有色物質(zhì)?；谏锩傅臋z測(cè)方法雖然具有高選擇性，但存在由生物酶帶來的成本高、儲(chǔ)存困難、易失活、穩(wěn)定性差、難以回收和再利用等缺點(diǎn)。因此開發(fā)新型無需生物酶的可穿戴微流控比色檢測(cè)芯片，用于汗液中肌酐的檢測(cè)，可望進(jìn)一步提高可穿戴檢測(cè)設(shè)備的穩(wěn)定性，對(duì)于腎臟疾病的早期診斷和健康預(yù)防管理具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于如何提供一種無生物酶的微流控比色檢測(cè)芯片及其在肌酐檢測(cè)中的應(yīng)用，達(dá)到汗液中肌酐的原位、快速、低成本檢測(cè)，為實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，主要包括以下技術(shù)方案。

2、本發(fā)明通過以下技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)解決上述技術(shù)問題的：

3、本發(fā)明的第一方面提出一種汗液肌酐檢測(cè)用微流控檢測(cè)芯片，所述微流控檢測(cè)芯片包括微流控通道層、檢測(cè)層和封裝層；所述檢測(cè)層裝填于微流控通道層上，所述封裝層位于微流控通道層之上；

4、所述微流控通道層設(shè)有進(jìn)樣口區(qū)、分流區(qū)、爆破閥凹槽、檢測(cè)區(qū)和空白對(duì)照區(qū)；

5、所述檢測(cè)層包括兩種檢測(cè)試劑修飾的紙芯片，一種為cu2+修飾的紙芯片，另一種為h2moo5納米酶和3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(tmb)共同修飾的紙芯片；

6、所述封裝層開設(shè)有進(jìn)樣孔，所述進(jìn)樣孔與微流控通道層的進(jìn)樣口相對(duì)應(yīng)。

7、優(yōu)選的，所述微流控通道層為pdms材質(zhì)。

8、優(yōu)選的，所述紙芯片的材質(zhì)為whatman?1號(hào)濾紙、醋酸纖維紙、硝酸纖維素膜、定性濾紙中的任意一種或多種。

9、優(yōu)選的，所述cu2+修飾的紙芯片是將cu2+溶液滴加在濾紙片上制得；所述h2moo5納米酶和3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(tmb)共同修飾的紙芯片通過在濾紙片上滴加醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，加入h2moo5納米酶，再加入tmb溶液，即得。

10、優(yōu)選的，所述h2moo5納米酶通過以下工藝制備：將mo粉末超聲分散在水中，在冰水浴條件下逐滴加入h2o2，加入冰醋酸，在室溫下充分反應(yīng)，直到出現(xiàn)橙黃色溶液，隨后，過濾得黃色濾液，干燥，煅燒，研磨，即得h2moo5納米酶。

11、優(yōu)選的，所述h2moo5納米酶和3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(tmb)修飾的紙芯片與微流控通道層上的檢測(cè)區(qū)、空白對(duì)照區(qū)相匹配；所述cu2+修飾的紙芯片與微流控通道層上的爆破閥凹槽相匹配。

12、本發(fā)明的第二方面提出上述汗液肌酐檢測(cè)用微流控檢測(cè)芯片的制備方法，包括以下步驟：將檢測(cè)層的h2moo5納米酶和3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(tmb)共同修飾的紙芯片裝填于微流控通道層上的檢測(cè)區(qū)、空白對(duì)照區(qū)，將cu2+修飾的紙芯片裝填于微流控通道層上的爆破閥凹槽中，將封裝層的進(jìn)樣孔與微流控通道層的進(jìn)樣口對(duì)齊，粘貼在填裝好紙芯片的微流控流通通道層上，完成對(duì)微流控通道的封裝，即得。

13、本發(fā)明的第三方面提出上述汗液肌酐檢測(cè)用微流控檢測(cè)芯片在汗液中肌酐水平檢測(cè)中的應(yīng)用。

14、本發(fā)明的第四方面提出一種h2moo5納米酶的制備方法，包括以下步驟：將mo粉末超聲分散在水中，在冰水浴條件下逐滴加入h2o2，加入冰醋酸，在室溫下充分反應(yīng)，直到出現(xiàn)橙黃色溶液，隨后，過濾得黃色濾液，干燥，煅燒，研磨，即得h2moo5納米酶。

15、本發(fā)明的第五方面提出上述制備方法制得的h2moo5納米酶。

16、本發(fā)明的第六方面提出上述h2moo5納米酶在制備汗液肌酐檢測(cè)用微流控檢測(cè)芯片上的應(yīng)用。

17、本發(fā)明可穿戴微流控比色檢測(cè)芯片的應(yīng)用，是將所述微流控比色檢測(cè)芯片用于汗液肌酐檢測(cè)，包括如下步驟：

18、步驟1：根據(jù)上述制備方法，將制備可穿戴微流控比色檢測(cè)芯片。

19、步驟2：將含有不同濃度肌酐的模擬汗液標(biāo)準(zhǔn)溶液滴加到進(jìn)樣孔，模擬汗液從進(jìn)樣孔進(jìn)入微流控比色檢測(cè)芯片，分流后流經(jīng)爆破區(qū)再進(jìn)入檢測(cè)區(qū)，在檢測(cè)區(qū)與紙芯片發(fā)生顯色反應(yīng)。10min后，利用智能手機(jī)拍照，獲取微流控比色檢測(cè)芯片的彩色圖片。

20、步驟3：使用圖片編輯軟件(如imagej軟件)獲取檢測(cè)區(qū)和空白對(duì)照區(qū)圖片的rgb值，利用兩個(gè)檢測(cè)區(qū)r值平均值與空白對(duì)照區(qū)r值之間的差值(△r)作為檢測(cè)信號(hào)，獲取用于肌酐定量檢測(cè)的線性曲線。

21、步驟4：將可穿戴微流控比色檢測(cè)芯片進(jìn)樣口朝下貼于運(yùn)動(dòng)者易出汗皮膚表面(如手臂、后背)，待汗液流進(jìn)檢測(cè)區(qū)發(fā)生顯色反應(yīng)后，拍照獲取△r值，根據(jù)上述肌酐定量線性曲線，計(jì)算實(shí)際汗液中肌酐濃度。

22、本發(fā)明的有益效果在于：

23、1、本發(fā)明用于肌酐檢測(cè)的微流控比色檢測(cè)芯片，使用穩(wěn)定且制備成本低的h2moo5納米酶-cu2+催化體系代替成本高、儲(chǔ)存困難、且易失活的生物酶催化體系，具有顯著提升的穩(wěn)定性和易儲(chǔ)存性。

24、2、本發(fā)明的微流控比色檢測(cè)芯片具有操作簡(jiǎn)單、便攜、柔軟、體積小等優(yōu)點(diǎn)，可直接穿戴于皮膚表面，實(shí)現(xiàn)微升級(jí)汗液中肌酐的實(shí)時(shí)、無創(chuàng)、高選擇性檢測(cè)，避免了繁瑣的汗液收集、預(yù)處理和大型檢測(cè)儀器的使用，為汗液肌酐檢測(cè)提供了新的技術(shù)。

25、3、本發(fā)明的微流控比色檢測(cè)芯片經(jīng)延伸拓展，可實(shí)現(xiàn)汗液中多種標(biāo)志物同時(shí)、實(shí)時(shí)、快速檢測(cè)，對(duì)于個(gè)人健康監(jiān)控和疾病的早期發(fā)現(xiàn)和監(jiān)測(cè)具有重要意義。