本發(fā)明涉及煙草化學(xué)分析，具體涉及一種煙草中蘋果酸衍生物的gc-ms檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

1、2-羥基-3-異丙基蘋果酸(3-isopropylmalic?acid)與2-異丙基蘋果酸(2-isopropylmalic?acid)是兩種重要的有機(jī)酸，廣泛存在于植物中，參與多種生物合成途徑，具有重要的生理功能和藥理作用。

2、2-羥基-3-異丙基蘋果酸是異戊醇的前體，異戊醇是一種高級(jí)醇，是植物的重要香氣成分，對(duì)植物的花粉管生長(zhǎng)和授粉有促進(jìn)作用。2-異丙基蘋果酸是亮氨酸的前體，亮氨酸是一種必需氨基酸，對(duì)植物的生長(zhǎng)、發(fā)育和抗逆性有重要作用。此外，2-羥基-3-異丙基蘋果酸與2-異丙基蘋果酸還具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌等多種藥理活性，是植物藥物的重要來(lái)源。因此，2-羥基-3-異丙基蘋果酸、2-異丙基蘋果酸具有較高的研究?jī)r(jià)值。

3、目前公開(kāi)的蘋果酸的檢測(cè)方法主要是液相色譜法或氣相色譜法，該方法是利用色譜柱對(duì)提取液中的待測(cè)化合物進(jìn)行分離。2023年4月21日申請(qǐng)公布的申請(qǐng)公布號(hào)為cn115993408a的中國(guó)專利公開(kāi)了一種煙用香精香料中檸檬酸、蘋果酸、乳酸、乙酸四種有機(jī)酸的測(cè)定方法，是將萃取得到的萃取液通過(guò)色譜柱前處理后采用離子排斥液相色譜定性分析有機(jī)酸成分。但是，由于植物樣本中基質(zhì)較為復(fù)雜，采用液相色譜或氣相色譜法檢測(cè)時(shí)前處理需要大量溶劑，色譜分析需要使用大量淋洗液，導(dǎo)致2-羥基-3-異丙基蘋果酸、2-異丙基蘋果酸的檢測(cè)面臨著溶劑消耗過(guò)多、分析時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的問(wèn)題，且離子排斥液相色譜法的定量分析結(jié)果準(zhǔn)確度不高，甚至無(wú)法定量分析。

4、2021年6月18日授權(quán)公告的授權(quán)公告號(hào)為cn109212066b的中國(guó)專利公開(kāi)了一種煙草及煙草制品中非脂肪類有機(jī)酸的測(cè)定方法，將煙葉磨成粉末在二氯甲烷萃取劑超聲萃取得到的萃取液進(jìn)行硅烷衍生化反應(yīng)，再進(jìn)行g(shù)c-ms/ms測(cè)試分析，非脂肪類有機(jī)酸包括3-羥基丙酸、2-羥基苯甲酸、肉桂酸、乳酸等。gc-ms/ms測(cè)試分析能夠極大降低溶劑消耗，并減少分析時(shí)間，但該檢測(cè)方法并沒(méi)有公開(kāi)針對(duì)2-羥基-3-異丙基蘋果酸和2-異丙基蘋果酸的檢測(cè)方法，兩種蘋果酸的檢測(cè)分析仍然存在定量檢測(cè)分析準(zhǔn)確性差的問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供一種煙草中蘋果酸衍生物的gc-ms檢測(cè)方法，解決現(xiàn)有技術(shù)中2-羥基-3-異丙基蘋果酸和2-異丙基蘋果酸兩種蘋果酸定量檢測(cè)分析準(zhǔn)確性差的問(wèn)題。

2、為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的煙草中蘋果酸衍生物的gc-ms檢測(cè)方法的技術(shù)方案為：

3、一種煙草中蘋果酸衍生物的gc-ms檢測(cè)方法，包括以下步驟：將待測(cè)樣品在萃取劑進(jìn)行萃取，萃取后采用衍生化試劑進(jìn)行衍生化反應(yīng)得到待測(cè)液，取待測(cè)液采用氣相色譜-質(zhì)譜法進(jìn)行測(cè)試分析；所述蘋果酸為2-羥基-3-異丙基蘋果酸和2-異丙基蘋果酸；

4、所述氣相色譜條件為：進(jìn)樣口溫度為290～300℃，采用程序升溫，60～70℃保持10～15min，然后以5～8℃/min的升溫速率升溫至290～310℃，在290～310℃保持10～15min；

5、所述質(zhì)譜條件為：采用srm掃描模式掃描，所述2-羥基-3-異丙基蘋果酸的離子對(duì)為191.1/73.1，保留時(shí)間為0.3～0.5min，碰撞能量為8～10ev；所述2-異丙基蘋果酸的離子對(duì)為73.1/45，保留時(shí)間為0.3～0.5min，碰撞能量為8～10ev。

6、本發(fā)明是對(duì)現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，提供的煙草中蘋果酸衍生物的gc-ms檢測(cè)方法，通過(guò)萃取后衍生化反應(yīng)，氣相色譜-質(zhì)譜分析時(shí)選用特定的進(jìn)樣口溫度、升溫程序及質(zhì)譜參數(shù)，使得2-羥基-3-異丙基蘋果酸和2-異丙基蘋果酸兩種酸的檢測(cè)分析具有較高的加標(biāo)回收率以及較低的檢出限，準(zhǔn)確性和靈敏度高，可用于2-羥基-3-異丙基蘋果酸和2-異丙基蘋果酸兩種酸的準(zhǔn)確定量測(cè)定。

7、為了進(jìn)一步提高樣品中待檢測(cè)化合物的萃取效果，優(yōu)選地，所述萃取劑為水。

8、為了進(jìn)一步提高待檢測(cè)化合物的萃取效率，優(yōu)選地，所述萃取為超聲萃取，所述超聲萃取溫度為25～30℃，超聲萃取時(shí)間為30～60min。

9、為了進(jìn)一步使樣品中的待檢測(cè)化合物萃取完全，優(yōu)選地，所述待測(cè)樣品和萃取劑的質(zhì)量體積比為20mg:(1.5～2)ml。

10、為了進(jìn)一步便于待檢測(cè)化合物量化以提高檢測(cè)靈敏度，優(yōu)選地，所述衍生化試劑為甲氧胺吡啶標(biāo)準(zhǔn)溶液和n,o-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺。

11、為了進(jìn)一步提高待檢測(cè)化合物的衍生化程度，優(yōu)選地，所述衍生化反應(yīng)為萃取得到的萃取液干燥后與甲氧胺吡啶標(biāo)準(zhǔn)溶液渦旋，進(jìn)行一次搖床孵育，再加入n,o-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺進(jìn)行二次搖床孵育。

12、為了進(jìn)一步提高待檢測(cè)化合物的衍生化效率，優(yōu)選地，所述一次搖床孵育的溫度為37～40℃，時(shí)間為90～100min，二次搖床孵育的溫度為60～70℃，時(shí)間為50～60min。

13、為了進(jìn)一步提高分離效果，優(yōu)選地，所述氣相色譜使用的色譜柱為agilent?db-5ms。

14、為了進(jìn)一步提高質(zhì)譜峰響應(yīng)程度，優(yōu)選地，所述氣相色譜采用氦氣作為載氣，流速為1.0～1.5ml/min，采用分流模式進(jìn)樣，分流比為10:1～50:1。

15、為了進(jìn)一步提高電離效率，優(yōu)選地，所述質(zhì)譜的離子源為ei，離子源溫度為290～300℃，傳輸線溫度為280～290℃。

技術(shù)特征：

1.一種煙草中蘋果酸衍生物的gc-ms檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟：將待測(cè)樣品在萃取劑進(jìn)行萃取，萃取后采用衍生化試劑進(jìn)行衍生化反應(yīng)得到待測(cè)液，取待測(cè)液采用氣相色譜-質(zhì)譜法進(jìn)行測(cè)試分析；所述蘋果酸為2-羥基-3-異丙基蘋果酸和2-異丙基蘋果酸；

2.如權(quán)利要求1所述的煙草中蘋果酸衍生物的gc-ms檢測(cè)方法，其特征在于，所述萃取劑為水。

3.如權(quán)利要求2所述的煙草中蘋果酸衍生物的gc-ms檢測(cè)方法，其特征在于，所述萃取為超聲萃取，所述超聲萃取溫度為25～30℃，超聲萃取時(shí)間為30～60min。

4.如權(quán)利要求1所述的煙草中蘋果酸衍生物的gc-ms檢測(cè)方法，其特征在于，所述待測(cè)樣品和萃取劑的質(zhì)量體積比為20mg:(1.5～2)ml。

5.如權(quán)利要求2所述的煙草中蘋果酸衍生物的gc-ms檢測(cè)方法，其特征在于，所述衍生化試劑為甲氧胺吡啶標(biāo)準(zhǔn)溶液和n,o-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺。

6.如權(quán)利要求5所述的煙草中蘋果酸衍生物的gc-ms檢測(cè)方法，其特征在于，所述衍生化反應(yīng)為萃取得到的萃取液干燥后與甲氧胺吡啶標(biāo)準(zhǔn)溶液渦旋，進(jìn)行一次搖床孵育，再加入n,o-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺進(jìn)行二次搖床孵育。

7.如權(quán)利要求6所述的煙草中蘋果酸衍生物的gc-ms檢測(cè)方法，其特征在于，所述一次搖床孵育的溫度為37～40℃，時(shí)間為90～100min，二次搖床孵育的溫度為60～70℃，時(shí)間為50～60min。

8.如權(quán)利要求1所述的煙草中蘋果酸衍生物的gc-ms檢測(cè)方法，其特征在于，所述氣相色譜使用的色譜柱為agilent?db-5ms。

9.如權(quán)利要求1所述的煙草中蘋果酸衍生物的gc-ms檢測(cè)方法，其特征在于，所述氣相色譜采用氦氣作為載氣，流速為1.0～1.5ml/min，采用分流模式進(jìn)樣，分流比為10:1～50:1。

10.如權(quán)利要求1所述的煙草中蘋果酸衍生物的gc-ms檢測(cè)方法，其特征在于，所述質(zhì)譜的離子源為ei，離子源溫度為290～300℃，傳輸線溫度為280～290℃。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于煙草化學(xué)分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種煙草中蘋果酸衍生物的GC?MS檢測(cè)方法。本發(fā)明提供的煙草中蘋果酸衍生物的GC?MS檢測(cè)方法包括待測(cè)樣品萃取后衍生化反應(yīng)得到待測(cè)液，進(jìn)行氣相色譜?質(zhì)譜測(cè)試，檢測(cè)的蘋果酸為2?羥基?3?異丙基蘋果酸和2?異丙基蘋果酸，進(jìn)樣口溫度為290～300℃，采用程序升溫，60～70℃保持10～15min，然后以5～8℃/min的升溫速率升溫至290～310℃，在290～310℃保持10～15min，采用SRM掃描模式掃描，所述2?羥基?3?異丙基蘋果酸和2?異丙基蘋果酸的離子對(duì)分別為191.1/73.1、73.1/45，兩者的保留時(shí)間為0.3～0.5min，碰撞能量為8～10eV。通過(guò)萃取后衍生化反應(yīng)，氣相色譜?質(zhì)譜分析時(shí)選用特定的進(jìn)樣溫度、升溫程序及質(zhì)譜參數(shù)，本發(fā)明的檢測(cè)方法具有較高的準(zhǔn)確性和靈敏度。

技術(shù)研發(fā)人員：劉萍萍,王龍鶴,鄭慶霞,張慧,李澤鋒,徐國(guó)云,翟妞,金立鋒,王晨,周會(huì)娜
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/2