本發(fā)明涉及玉米赤霉烯酮檢測，尤其涉及一種玉米赤霉烯酮免疫磁珠及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、玉米赤霉烯酮(zearalenone，zen)，俗稱f-2毒素，主要由禾谷鐮刀菌產(chǎn)生，可廣泛污染玉米、大豆、小麥等農(nóng)作物，是食品和飼料中最常見的真菌毒素之一。zen對人體和動(dòng)物具有急慢性毒性、免疫毒性、生殖毒性和“三致”(致癌、致畸、致突變)等毒性作用，是世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究中心公布的3類致癌物。此外，由于zen與雌二醇具有類似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，能夠與機(jī)體雌激素受體相結(jié)合，從而產(chǎn)生擬雌激素樣作用，具有明顯的內(nèi)分泌干擾活性，也是世界自然基金會(huì)公布的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(endocrine-disrupting?chemicals，edcs)。zen在飼料中的污染范圍廣，hao等對2017～2021五年間的9392份飼料和飼料原料樣品進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)一半以上飼料樣品檢出zen(檢出率56.29％)，平均檢出含量為183.81μg/kg，且大部分為兩種以上真菌毒素的復(fù)合污染。曾睿等對華南地區(qū)的232份家禽配合飼料進(jìn)行了zen、赭曲霉毒素a、柄曲霉素三種真菌毒素的監(jiān)測分析，發(fā)現(xiàn)所有飼料樣品中均檢出zen(檢出率100％)，檢出含量為1.00～53.61μg/kg(平均8.59μg/kg)。

2、此外，隱蔽型毒素如zen-14-葡萄糖苷(zearalenone-14-glucoside，zen-14g)、zen-14-磺酸(zearalenone-14-sulfate，zen-14s)等的發(fā)現(xiàn)，亦增加了其暴露風(fēng)險(xiǎn)。鑒于zen對養(yǎng)殖動(dòng)物的毒性作用以及在飼料中廣泛的污染性，建立飼料中zen的準(zhǔn)確、快速、高通量的定量分析方法，對于飼料中真菌毒素的暴露評估和風(fēng)險(xiǎn)防控具有重要意義。

3、目前，飼料中zen常用檢測方法主要包括膠體金試紙卡、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(elisa)、免疫側(cè)流層析等快速檢測法，以及氣相色譜(gc)、氣相色譜-質(zhì)譜(gc-ms)、高效液相色譜(hplc)和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(lc-ms/ms)等儀器確證分析方法。elisa、膠體金試紙卡、免疫測流層析等快檢技術(shù)容易因抗體的交叉反應(yīng)出現(xiàn)假陽性；gc、gc-ms往往需要衍生化，前處理繁雜，衍生化產(chǎn)物的穩(wěn)定性也較差。hplc法因操作簡便、穩(wěn)定可靠、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，是最為常用的真菌毒素定量分析技術(shù)。此外，lc-ms/ms正越來越廣泛的用于飼料中真菌毒素的定性和定量檢測，但由于其儀器價(jià)格昂貴、操作復(fù)雜，且電噴霧電離源(esi)固有的基質(zhì)效應(yīng)也易影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確性，從而限制了其在飼料行業(yè)的大規(guī)模應(yīng)用。在hplc、lc-ms/ms定量分析之前需要對樣品進(jìn)行凈化處理，毒素分析常用的凈化技術(shù)有固相萃取柱法(solid-phase?extraction，spe)、quechers、免疫親和柱凈化(immunoaffinity?column，iac)等。飼料行業(yè)現(xiàn)行有效的國家標(biāo)準(zhǔn)《飼料中玉米赤霉烯酮的測定免疫親和柱凈化-高效液相色譜法》(gb/t28716-2012)即采用iac進(jìn)行樣品凈化。盡管iac相較于傳統(tǒng)spe、quechers法具有更好的選擇性和凈化效果，被各類不同樣品基質(zhì)干擾的影響也較小，但受抗體影響穩(wěn)定性較差，價(jià)格昂貴、檢測成本高，且純手動(dòng)操作的處理過程耗時(shí)也較長。

4、免疫磁珠(immunomagnetic?beads，imbs)是20世紀(jì)70年代后期發(fā)展起來的一種磁載體分離技術(shù)，同時(shí)具備了免疫學(xué)的高度特異性以及磁性納米材料的超順磁性、尺寸小、可進(jìn)行多樣化修飾等顯著特點(diǎn)，可在外加磁場的作用下快速捕捉、分離目標(biāo)化合物，避免了繁瑣的過濾或離心等固-液分離過程，從而有望實(shí)現(xiàn)集提取、凈化、濃縮于一體的快速樣品前處理技術(shù)。imbs最初主要應(yīng)用于核酸、蛋白、微生物等生物大分子的分離純化，近幾年因其操作簡便、耗時(shí)短、可批量自動(dòng)化處理等優(yōu)勢受到了廣泛關(guān)注，并逐漸應(yīng)用于真菌毒素、獸藥殘留等小分子檢測。chen等采用n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)活化磁性fe3o4納米材料與黃曲霉毒素m1(afm1)單抗偶聯(lián)制備免疫磁珠，結(jié)合lc-ms/ms建立了牛奶中afm1殘留的確證檢測方法，實(shí)現(xiàn)了13min內(nèi)24個(gè)牛奶樣品的快速處理。wang等采用溴化氫活化瓊脂糖凝膠(cnbr)與黃曲霉毒素、伏馬毒素、t-2毒素和環(huán)匹阿尼酸(cyclopiazonic?acid，cpa)的混合單抗進(jìn)行偶聯(lián)，成功構(gòu)建了afb1、afb2、afg1、afg2、fb1、t-2和cpa七種真菌毒素的免疫磁珠凈化uplc-ms/ms同步確證分析方法?？傮w而言，與iac相比，免疫磁珠凈化成本更低，可實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化處理，解放了試驗(yàn)人員雙手，可顯著提高工作效率和檢測通量。

5、盡管近年來imbs分離技術(shù)已在食品安全研究領(lǐng)域得到了部分應(yīng)用，但其在飼料質(zhì)量安全分析中的相關(guān)研究仍然匱乏。因此，如何提供一種用于飼料中有害物質(zhì)赤霉烯酮的快速測定方法，以解決上述的技術(shù)問題，是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟需解決的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種玉米赤霉烯酮免疫磁珠及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明利用imbs高通量全自動(dòng)凈化結(jié)合高效液相色譜儀，建立了一種快速便捷、可批量自動(dòng)化處理飼料和飼料原料樣品中zen的方法，并在此基礎(chǔ)上研究制定了首個(gè)關(guān)于imbs凈化技術(shù)的飼料工業(yè)協(xié)會(huì)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)，以期為基層檢測實(shí)驗(yàn)室和飼料企業(yè)防控真菌毒素污染提供方法參考。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供了一種玉米赤霉烯酮免疫磁珠的制備方法，包括如下步驟：

4、(1)使用乙醇清洗n-羥基琥珀酰亞胺活化的瓊脂糖磁珠，去除乙醇后，加入2-嗎啉乙磺酸緩沖液和zen單克隆抗體混合孵育，棄去上層溶液；

5、(2)向步驟(1)孵育后的磁珠中加入含甘氨酸的緩沖液混合封閉，磁吸分離，淋洗后得到zen免疫磁珠。

6、優(yōu)選的，步驟(1)所述瓊脂糖磁珠、2-嗎啉乙磺酸緩沖液和zen單克隆抗體的比例為0.8～1.2ml：0.8～1.2ml：1.8～2.2mg；所述孵育的時(shí)間為100～140min，溫度為36～38℃，搖床的轉(zhuǎn)速為180～220rpm。

7、優(yōu)選的，步驟(1)所述瓊脂糖磁珠與乙醇的體積比為1：8～12；所述乙醇為無水乙醇；所述清洗的時(shí)間為4～6min。

8、優(yōu)選的，步驟(2)所述含甘氨酸的緩沖液與瓊脂糖磁珠的體積比為0.8～1.2：0.8～1.2；所述含甘氨酸的緩沖液中甘氨酸的含量為2～3％(m：v)；所述封閉的時(shí)間為50～70min，溫度為36～38℃，搖床的轉(zhuǎn)速為180～220rpm；所述淋洗的方法為：先后用含0.1～0.2％(v：v)吐溫-20的pbs緩沖液和pbs緩沖液淋洗2～3次。

9、本發(fā)明還提供了所述的方法得到的免疫磁珠。

10、優(yōu)選的，所述免疫磁珠的粒徑為10nm～2μm。

11、本發(fā)明還提供了一種用于玉米赤霉烯酮檢測玉米赤霉烯酮的試劑盒，包括a倉、b倉、c倉、d倉和e倉；所述a倉為待測樣本，b倉為權(quán)利要求5或6所述免疫磁珠，c倉為pbs清洗液，d倉為水清洗液，e倉為甲醇洗脫液。

12、本發(fā)明還提供了所述的試劑盒在玉米赤霉烯酮檢測中的應(yīng)用。

13、優(yōu)選的，所述試劑盒的使用方法為：將所述免疫磁珠凈化后進(jìn)行hplc測定。

14、優(yōu)選的，所述凈化使用的儀器為真菌毒素全自動(dòng)凈化儀；

15、所述凈化的方法為：1)磁棒將免疫磁珠從b倉轉(zhuǎn)移到a倉，磁棒混合10～14min，磁吸55～65s；2)磁棒將免疫磁珠轉(zhuǎn)移至c倉，清洗55～65s，磁吸55～65s；3)免疫磁珠轉(zhuǎn)移d倉，清洗55～65s，磁吸55～65s；4)免疫磁珠轉(zhuǎn)移到e倉進(jìn)行洗脫，洗脫55～65s，磁吸55～65s后將免疫磁珠轉(zhuǎn)移到b倉，凈化程序結(jié)束；

16、所述hplc測定條件設(shè)置為：色譜柱：agilent?zorbax?sb-c18柱；柱溫：38～42℃；進(jìn)樣量45～55μl；流動(dòng)相：乙腈/水＝55/45，等度洗脫；流速0.7～0.9ml/min；熒光檢測器：激發(fā)波長274nm，發(fā)射波長440nm。

17、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：

18、本發(fā)明研究旨在建立利用免疫磁珠高通量全自動(dòng)凈化結(jié)合高效液相色譜快速測定飼料中玉米赤霉烯酮的方法。首先將n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)活化的瓊脂糖磁珠與玉米赤霉烯酮單克隆抗體孵育制備zen免疫磁珠，并采用掃描電鏡、振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)對其進(jìn)行了表征。飼料樣品用80％乙腈水提取，經(jīng)全自動(dòng)免疫磁珠凈化后，采用高效液相色譜-熒光檢測器測定，外標(biāo)法定量。

19、結(jié)果表明：玉米赤霉烯酮在0.01～1.0μg/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r2≥0.9999)，方法檢出限為2μg/kg，定量限為10μg/kg；玉米赤霉烯酮在0.01、0.02、0.10和1.0mg/kg四個(gè)添加濃度水平下的平均回收率為86.90％～100.27％，批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(rsd)為3.18％～9.88％，批間rsd為4.94％～9.40％。

20、與傳統(tǒng)固相萃取、免疫親和柱凈化法相比，免疫磁珠凈化集提取、分離、凈化、濃縮于一體，可實(shí)現(xiàn)完全自動(dòng)化處理，顯著提高工作效率和檢測通量，避免因人為操作導(dǎo)致的結(jié)果偏差，適用于大批量飼料樣本中玉米赤霉烯酮的測定。