本申請(qǐng)涉及蛋白質(zhì)和酶工程，尤其涉及一種利用分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)合蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)挖掘蛋白酶催化性能遠(yuǎn)端調(diào)控關(guān)鍵氨基酸。

背景技術(shù)：

1、當(dāng)前蛋白水解酶食品工業(yè)等領(lǐng)域具有重要作用，如在如肉質(zhì)地嫩滑、飲料生產(chǎn)、乳制品加工以提高食物營養(yǎng)價(jià)值、溶解度以及改善新陳代謝過程具有重要的意義。據(jù)估計(jì)2024年蛋白酶市場(chǎng)將達(dá)到31.2億美元，其中乳酶市場(chǎng)估計(jì)為7.3億美元(d?s,trends?food?sci.tech.,2022)。

2、通常蛋白酶對(duì)同源底物通常具有顯著的特異性，酶與底物(8個(gè)氨基酸殘基，其中裂解位點(diǎn)n端方向?yàn)閜4-p1，裂解位點(diǎn)c端方向命名為p1'-p4')利用預(yù)先存在的構(gòu)象通過誘導(dǎo)契合效應(yīng)進(jìn)行結(jié)合(fernández-lucas,j.trends?food?sci?technol,2017)；但一些酶同時(shí)還表現(xiàn)出對(duì)非同源底物具有弱的催化能力，這些不穩(wěn)定的低的催化功能為酶的次級(jí)功能，也稱為酶的催化混雜，具有從狹義(專一型)到廣義(通用型)的底物偏好范圍不等的連續(xù)特征，酶混雜性的存在大大減弱了其水解專一性的能力。

3、乳蛋白被認(rèn)為是抗高血壓肽的重要來源，而傳統(tǒng)食品加工如制備生物活性肽中，通常采用的是以高能耗、長(zhǎng)時(shí)間以及高水解度為代價(jià)制備功能性肽，如espejo-carpio?fj,int?dairy?j,2013)等利用枯草桿菌蛋白酶、胰蛋白酶及其組合酶解技術(shù)在50℃水解乳蛋白3h，其水解物對(duì)ace抑制率在33％～64％，經(jīng)組分分離截留后其中復(fù)合酶解最小分子量組分的ic50最佳的達(dá)到5.12ug/ml，但其水解度高達(dá)32％左右，而搞水解度的最小分分子量組分勢(shì)必存在苦味肽，由此產(chǎn)生不良口感。據(jù)此，國內(nèi)外學(xué)者開始研究定向制備功能肽的技術(shù)，如lin?k,j?agri?food?chem,2018)等基于酪蛋白富含芳香族氨基酸殘基，利用計(jì)算機(jī)模擬酶切建立的嗜熱蛋白酶-堿性蛋白酶分步酶解技術(shù)(50℃→70℃，2h)，其中小于3kda組分的ace抑制活性ic50為2.63ug/ml，雖然一定程度上降低了加工時(shí)間，但是其水解度仍然是很高(28.9％)。此外，mazorra-manzano,t.c.,(food?chem.2013)報(bào)道從柑橘花、銀葉砌和香瓜分離的粗酶中發(fā)現(xiàn)乳清蛋白在甜瓜酶粗提物中基本完全降解，其中小于10kda的水解物對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性雖然能達(dá)到90％，但是該技術(shù)耗時(shí)高達(dá)24h，表明該酶的活性還有待提高。

4、通常在現(xiàn)有商業(yè)化蛋白酶不能滿足生產(chǎn)需求時(shí)，學(xué)者會(huì)通過各種途徑利用關(guān)鍵蛋白從自然界中重新篩選蛋白酶，這無異于大海撈針，因此存在工作量巨大，同時(shí)成本也是昂貴的。就算幸運(yùn)篩選得到有符合特異性水解能力的蛋白酶，由于宿主基因表達(dá)水平低、酶的不穩(wěn)定性以及ph和溫度不適宜等問題引起酶活性低和產(chǎn)量不高等問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本申請(qǐng)?zhí)峁┮环N利用分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)合蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)挖掘蛋白酶催化性能遠(yuǎn)端調(diào)控關(guān)鍵氨基酸，以解決現(xiàn)有技術(shù)中酶定向進(jìn)化的成功率低的問題，實(shí)現(xiàn)了提高木瓜蛋白酶水解專一性進(jìn)而靶向降解αs1-cn主要過敏原表位的目的，為強(qiáng)化木瓜蛋白酶靶向消減cn抗原性提供理論支撐。

2、本申請(qǐng)?zhí)峁┮环N利用分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)合蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)挖掘蛋白酶催化性能遠(yuǎn)端調(diào)控關(guān)鍵氨基酸，包括以下步驟：

3、a、首先通過溫度擾動(dòng)的迭代構(gòu)象動(dòng)力學(xué)結(jié)合最短路徑分析挖掘木瓜蛋白酶可能存在的遠(yuǎn)端調(diào)控路徑；

4、b、以大腸桿菌bl21為工程菌株，質(zhì)粒pet28a為木瓜蛋白酶基因表達(dá)載體，利用異源表達(dá)技術(shù)表達(dá)木瓜蛋白酶突變體，通過分離純化、體外活化獲得木瓜蛋白酶突變體純品，并以此制備酪蛋白水解物，通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)驗(yàn)證關(guān)鍵氨基酸殘基對(duì)木瓜蛋白酶催化專一性的影響。

5、優(yōu)選的，4條潛在遠(yuǎn)端調(diào)控路徑分別為：

6、路徑1：96+95位點(diǎn)通過loop2→α3→α2路徑影響催化三聯(lián)體(c25)；

7、路徑2：83+82+81位點(diǎn)通過loop2→loop1→α3→α2路徑影響催化三聯(lián)體(c25)；

8、路徑3：44+45位點(diǎn)loop1→α2路徑影響催化三聯(lián)體(c25)；

9、路徑4：101+102位點(diǎn)則通過loop2→反向鉸鏈→β-桶結(jié)構(gòu)路徑影響催化三聯(lián)體(n175)。

10、優(yōu)選的，關(guān)鍵遠(yuǎn)端調(diào)控氨基酸殘基為：n44，y82，r83和r96。

11、優(yōu)選的，遠(yuǎn)端spm主要位于loop1和loop2中，在loop1中出現(xiàn)了3個(gè)高頻的spm位點(diǎn)，分別為n44，l45和e50，其中e50根據(jù)sasa值判斷為內(nèi)部氨基酸殘基，不利于修飾；n44在木瓜蛋白酶內(nèi)部存在比較大的氫鍵相互作用力，通過氫鍵網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)對(duì)木瓜蛋白酶的催化中心進(jìn)行調(diào)控，n44可作為遠(yuǎn)端調(diào)控的候選氨基酸殘基。

12、優(yōu)選的，loop2中存在最多spm位點(diǎn)，spm主要集中分布在3個(gè)區(qū)段，分別為80-83，95-96和102-108，在80-83區(qū)段中，根據(jù)80-81的sasa值，可判定其為內(nèi)部氨基酸殘基，被修飾的可能性極低；r83則通過鹽鍵和氫鍵表現(xiàn)出與木瓜蛋白酶網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)存在強(qiáng)烈的相互作用，y82與木瓜蛋白酶網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)相互作用力相對(duì)較弱；在95-96區(qū)段中，r96通過鹽鍵和氫鍵表現(xiàn)出與木瓜蛋白酶網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)存在強(qiáng)烈的相互作用，c95與木瓜蛋白酶網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)相互作用力相對(duì)較弱；由此y82，r83和r96作為遠(yuǎn)端調(diào)控候選氨基酸殘基。

13、優(yōu)選的，在102-108區(qū)段中，出現(xiàn)的spm頻率相對(duì)低一點(diǎn)，其中根據(jù)sasa值判斷，102，105和107為內(nèi)部氨基酸殘基，103與木瓜蛋白酶整體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)相互作用較弱，106和108顯示出于木瓜蛋白酶網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)有較強(qiáng)的相互作用，101-102位點(diǎn)通過loop2→反向鉸鏈→β-桶結(jié)構(gòu)路徑影響催化三聯(lián)體(n175)。

14、優(yōu)選的，位于loop2的83酪氨酸+82精氨酸聯(lián)合突變對(duì)酪氨酸殘基選擇性(對(duì)數(shù)概率二項(xiàng)概率值)由1.4增加至6.6，提高了4.7倍。

15、有益效果：本發(fā)明能夠?qū)崿F(xiàn)提高木瓜蛋白酶水解專一性進(jìn)而靶向降解αs1-cn主要過敏原表位的目的，為強(qiáng)化木瓜蛋白酶靶向消減cn抗原性提供理論支撐；本發(fā)明首先基于結(jié)合分子動(dòng)力學(xué)模擬-半理性設(shè)計(jì)-異源表達(dá)聯(lián)合液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)挖掘得到木瓜蛋白酶遠(yuǎn)端調(diào)控主要路徑和關(guān)鍵調(diào)控氨基酸殘基，與現(xiàn)有傳統(tǒng)酶定向進(jìn)化技術(shù)相比，減少了工作量和成本，提高了酶定向進(jìn)化的成功率。

16、上述說明僅是本申請(qǐng)實(shí)施例技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本申請(qǐng)實(shí)施例的技術(shù)手段，而可依照說明書的內(nèi)容予以實(shí)施，并且為了讓本申請(qǐng)實(shí)施例的上述和其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能夠更明顯易懂，以下特舉本申請(qǐng)的具體實(shí)施方式。

技術(shù)特征：

1.一種利用分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)合蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)挖掘蛋白酶催化性能遠(yuǎn)端調(diào)控關(guān)鍵氨基酸，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)合蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)挖掘蛋白酶催化性能遠(yuǎn)端調(diào)控關(guān)鍵氨基酸，其特征在于，4條潛在遠(yuǎn)端調(diào)控路徑分別為：

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種利用分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)合蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)挖掘蛋白酶催化性能遠(yuǎn)端調(diào)控關(guān)鍵氨基酸，其特征在于，關(guān)鍵遠(yuǎn)端調(diào)控氨基酸殘基為：n44，y82，r83和r96。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種利用分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)合蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)挖掘蛋白酶催化性能遠(yuǎn)端調(diào)控關(guān)鍵氨基酸，其特征在于，遠(yuǎn)端spm主要位于loop1和loop2中，在loop1中出現(xiàn)了3個(gè)高頻的spm位點(diǎn)，分別為n44，l45和e50，其中e50根據(jù)sasa值判斷為內(nèi)部氨基酸殘基，不利于修飾；n44在木瓜蛋白酶內(nèi)部存在比較大的氫鍵相互作用力，通過氫鍵網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)對(duì)木瓜蛋白酶的催化中心進(jìn)行調(diào)控，n44可作為遠(yuǎn)端調(diào)控的候選氨基酸殘基。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種利用分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)合蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)挖掘蛋白酶催化性能遠(yuǎn)端調(diào)控關(guān)鍵氨基酸，其特征在于，loop2中存在最多spm位點(diǎn)，spm主要集中分布在3個(gè)區(qū)段，分別為80-83，95-96和102-108，在80-83區(qū)段中，根據(jù)80-81的sasa值，可判定其為內(nèi)部氨基酸殘基，被修飾的可能性極低；r83則通過鹽鍵和氫鍵表現(xiàn)出與木瓜蛋白酶網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)存在強(qiáng)烈的相互作用，y82與木瓜蛋白酶網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)相互作用力相對(duì)較弱；在95-96區(qū)段中，r96通過鹽鍵和氫鍵表現(xiàn)出與木瓜蛋白酶網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)存在強(qiáng)烈的相互作用，c95與木瓜蛋白酶網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)相互作用力相對(duì)較弱；由此y82，r83和r96作為遠(yuǎn)端調(diào)控候選氨基酸殘基。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)合蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)挖掘蛋白酶催化性能遠(yuǎn)端調(diào)控關(guān)鍵氨基酸，其特征在于，在102-108區(qū)段中，出現(xiàn)的spm頻率相對(duì)低一點(diǎn)，其中根據(jù)sasa值判斷，102，105和107為內(nèi)部氨基酸殘基，103與木瓜蛋白酶整體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)相互作用較弱，106和108顯示出于木瓜蛋白酶網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)有較強(qiáng)的相互作用，101-102位點(diǎn)通過loop2→反向鉸鏈→β-桶結(jié)構(gòu)路徑影響催化三聯(lián)體(n175)。

7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)合蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)挖掘蛋白酶催化性能遠(yuǎn)端調(diào)控關(guān)鍵氨基酸，其特征在于，所述步驟b中83酪氨酸+82精氨酸聯(lián)合突變對(duì)酪氨酸殘基選擇性(對(duì)數(shù)概率二項(xiàng)概率值)由1.4增加至6.6，提高了4.7倍。

技術(shù)總結(jié)
本申請(qǐng)?zhí)峁┮环N利用分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)合蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)挖掘蛋白酶催化性能遠(yuǎn)端調(diào)控關(guān)鍵氨基酸，首先通過溫度擾動(dòng)的迭代構(gòu)象動(dòng)力學(xué)結(jié)合最短路徑分析挖掘木瓜蛋白酶可能存在的遠(yuǎn)端調(diào)控路徑，基于最短路徑殘基貢獻(xiàn)率以及分子間相互作用和殘基溶劑化面積可及性確定關(guān)鍵路徑的遠(yuǎn)端調(diào)控氨基酸殘基；最后利用異源表達(dá)技術(shù)表達(dá)木瓜蛋白酶突變體，通過分離純化、體外活化獲得木瓜蛋白酶突變體純品，通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)驗(yàn)證關(guān)鍵氨基酸殘基對(duì)木瓜蛋白酶催化專一性的影響；得到木瓜蛋白酶催化性能的潛在調(diào)控路徑和關(guān)鍵氨基酸殘基。本發(fā)明能夠?qū)崿F(xiàn)提高木瓜蛋白酶水解專一性進(jìn)而靶向降解αs1?CN主要過敏原表位的目的，為強(qiáng)化木瓜蛋白酶靶向消減CN抗原性提供理論支撐。

技術(shù)研發(fā)人員：張?zhí)m威,曾劍華,公不民,鄒俊哲,何劍
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中國海洋大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/2