本發(fā)明涉及分析方法，具體而言，涉及一種替考拉寧組分解析的液質(zhì)分析方法。

背景技術：

1、目前，分析化學藥品組分及雜質(zhì)的方法多為高效液相色譜法(hplc)。但是，在采用hplc分析發(fā)酵產(chǎn)生的家族化合物(如替考拉寧)時，因替考拉寧存在組分及雜質(zhì)眾多，且其在放置期間容易出現(xiàn)各組分相互轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，并且難以獲得所有組分及雜質(zhì)的標準品用于逐個成分的定性及定量，從而會導致檢測定性不充分，檢測范圍存在不足。同時，由于已有的高效液相色譜法的色譜條件與液質(zhì)聯(lián)用方法的儀器不兼容，因此，有必要提供一種新的替考拉寧的分析方法，以改善上述問題。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的主要目的在于開發(fā)了一種替考拉寧組分解析的液質(zhì)分析方法，以解決現(xiàn)有技術中藥典方法與質(zhì)譜方法色譜條件不兼容，難以進行替考拉寧組分及雜質(zhì)的分離與鑒定的問題。

2、為了實現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種替考拉寧組分解析的液質(zhì)分析方法，包括以下步驟：步驟s1，采用一維hplc方法，對待測樣品進行分析，確定檢出量大于鑒定限0.25％的組分及雜質(zhì)的峰位及其出峰順序，并分別進行富集，得到組分富集樣、雜質(zhì)富集樣；步驟s2，采用二維lc-hrms方法，在正離子模式下對組分富集樣及雜質(zhì)富集樣進行一級全掃描，分別得到各個物質(zhì)的準分子離子峰并計算其分子式，再對各個準分子離子峰分別進行二級掃描，以得到其對應的主要碎片離子，進而得到各化合物的結構及其ms2裂解途徑；其中，一維hplc的流動相包括a1相和b1相，a1相為磷酸鹽溶液和乙腈的混合溶液，b1相為磷酸鹽溶液和乙腈的混合溶液；二維lc-hrms的流動相包括a2相和b2相，a2相為甲酸水溶液，b2相為乙腈，lc-hrms所采用的離子源為電噴霧電離。

3、進一步地，一維hplc的色譜條件為：檢測波長254nm；采用thermo?ods-hypersil色譜柱；所用流動相包括a1相和b1相，a1相為磷酸鹽溶液和乙腈體積比為90:10的混合溶液，b1相為磷酸鹽溶液和乙腈體積比為30:70的混合溶液；二維lc-hrms的色譜條件為：檢測波長210nm，254nm；采用agilent?zorbax?sb-c18色譜柱；所用流動相包括a2相和b2相，a2相為甲酸水溶液，b2相為乙腈。

4、進一步地，磷酸鹽溶液通過以下方法制備：取無水磷酸二氫鈉3.0g，加水溶解制成1000ml，用1mol/l氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)ph至6.0±0.05，再用0.45μm濾膜過濾；甲酸水溶液通過以下方法制備：取1.0ml甲酸至1000ml超純水中，搖勻，超聲。

5、進一步地，hplc采用梯度洗脫程序，其包括順次進行的第一洗脫過程、第二洗脫過程、第三洗脫過程、第四洗脫過程和第五洗脫過程；第一洗脫過程的處理時間為20～40min，在第一洗脫過程中，a1相的體積用量由100％逐漸減少為50％，b1相的體積用量由0％逐漸增加為50％；第二洗脫過程的處理時間為0.5～1.5min，在第二洗脫過程中，a1相的體積用量由50％逐漸減少為10％，b1相的體積用量由50％逐漸增加為90％；第三洗脫過程的處理時間為3～5min，在第三洗脫過程中，a1相的體積用量為10％，b1相的體積用量為90％；第四洗脫過程的處理時間為0.5～1.5min，在第四洗脫過程中，a1相的體積用量由10％逐漸增加為100％，b1相的體積用量由90％逐漸減少為0％；第五洗脫過程的處理時間為7～11min，在第五洗脫過程中，a1相的體積用量為100％，b1相的體積用量為0％。

6、進一步地，lc-hrms采用梯度洗脫程序，其包括順次進行的第六洗脫過程、第七洗脫過程、第八洗脫過程和第九洗脫過程；第六洗脫過程的處理時間為2～4min，在第六洗脫過程中，a2相的體積用量由95％逐漸減少為0％，b2相的體積用量由5％逐漸增加為100％；第七洗脫過程的處理時間為2～4min，在第七洗脫過程中，a2相的體積用量為0％，b2相的體積用量為100％；第八洗脫過程的處理時間為0.005～0.015min，在第八洗脫過程中，a2相的體積用量由0％逐漸增加為95％，b2相的體積用量由100％逐漸減少為5％；第九洗脫過程的處理時間為1.5～2.5min，在第九洗脫過程中，a2相的體積用量為95％，b2相的體積用量為5％。

7、進一步地，hplc中，待測樣品的進樣量為15～25μl。

8、進一步地，lc-hrms中，組分富集樣的進樣量為0.5～1.0μl，雜質(zhì)富集樣的進樣量為24～26μl。

9、進一步地，lc-hrms的柱溫為20～30℃，樣品盤溫度為2～8℃。

10、進一步地，lc-hrms中，離子源的噴霧溫度為275～400℃，離子源噴霧電壓為負3000～正3500v。

11、進一步地，lc-hrms的質(zhì)譜條件為：一級質(zhì)譜分辨率為70000；二級質(zhì)譜分辨率為35000；鞘氣壓力為5～75arb；輔助氣壓力為0～20arb；掃描范圍為50～750m/z；100～3500m/z；一級質(zhì)譜離子累積時間為100ms；二級質(zhì)譜離子累積時間為50ms；一級質(zhì)譜離子累積量為1e6；二級質(zhì)譜離子累積量為1e5。

12、應用本發(fā)明的技術方案，開發(fā)出一種優(yōu)化的替考拉寧的分離和分析條件，以便使得hplc與lc-hrms兼容，解決了原藥典液相方法色譜條件與液質(zhì)儀器不兼容的問題。本發(fā)明先將液相色譜技術用于分離樣品中的組分及雜質(zhì)，進一步提高了組分與雜質(zhì)的分離度，以便進行后續(xù)分析；采用液質(zhì)聯(lián)用技術對液相色譜分離出的各組分及雜質(zhì)結構進行鑒定，實現(xiàn)對超過鑒定限的組分及雜質(zhì)的結構解析。本發(fā)明的聯(lián)用方法可以對不同來源的發(fā)酵家族化合物替考拉寧樣品進行對比分析，明確組分及雜質(zhì)出峰順序，實現(xiàn)組分及雜質(zhì)的分離，并進一步進行結構鑒定，從而評價產(chǎn)品藥學基礎的一致性。

技術特征：

1.一種替考拉寧組分解析的液質(zhì)分析方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據(jù)權利要求1所述的液質(zhì)分析方法，其特征在于，

3.根據(jù)權利要求2所述的液質(zhì)分析方法，其特征在于，

4.根據(jù)權利要求2或3所述的液質(zhì)分析方法，其特征在于，所述hplc采用梯度洗脫程序，其包括順次進行的第一洗脫過程、第二洗脫過程、第三洗脫過程、第四洗脫過程和第五洗脫過程；

5.根據(jù)權利要求2至4中任一項所述的液質(zhì)分析方法，其特征在于，所述lc-hrms采用梯度洗脫程序，其包括順次進行的第六洗脫過程、第七洗脫過程、第八洗脫過程和第九洗脫過程；

6.根據(jù)權利要求1至5中任一項所述的液質(zhì)分析方法，其特征在于，所述hplc中，所述待測樣品的進樣量為15～25μl。

7.根據(jù)權利要求1至6中任一項所述的液質(zhì)分析方法，其特征在于，所述lc-hrms中，所述組分富集樣的進樣量為0.5～1.0μl，所述雜質(zhì)富集樣的進樣量為24～26μl。

8.根據(jù)權利要求1至7中任一項所述的液質(zhì)分析方法，其特征在于，所述lc-hrms的柱溫為20～30℃，樣品盤溫度為2～8℃。

9.根據(jù)權利要求1至8中任一項所述的液質(zhì)分析方法，其特征在于，所述lc-hrms中，所述離子源的噴霧溫度為275～400℃，離子源噴霧電壓為負3000～正3500v。

10.根據(jù)權利要求1至9中任一項所述的液質(zhì)分析方法，其特征在于，所述lc-hrms的質(zhì)譜條件為：

技術總結
本發(fā)明提供了一種替考拉寧組分解析的液質(zhì)分析方法。先采用一維HPLC方法對待測樣品進行分析，然后采用二維LC?HRMS方法，在正離子模式下對組分富集樣及雜質(zhì)富集樣進行一級全掃描，再對各個準分子離子峰分別進行二級掃描，進而得到各化合物的結構及其MS<supgt;2</supgt;裂解途徑；一維HPLC的流動相包括磷酸鹽溶液和乙腈的混合溶液，二維LC?HRMS的流動相包括甲酸水溶液和乙腈。本發(fā)明的方法中色譜條件與液質(zhì)儀器兼容性佳，可以對不同來源的發(fā)酵家族化合物替考拉寧樣品進行對比分析，明確組分及雜質(zhì)出峰順序，實現(xiàn)組分及雜質(zhì)的分離，并進一步進行結構鑒定，從而評價產(chǎn)品藥學基礎的一致性。

技術研發(fā)人員：張曉燕,杜加秋,趙技宇,徐慧娟,易芬芬,邵婷婷,金楊巧
受保護的技術使用者：瀚暉制藥有限公司
技術研發(fā)日：
技術公布日：2025/1/2