本發(fā)明涉及熒光免疫層析檢測(cè)，具體涉及一種檢測(cè)黃曲霉毒素b1的熒光微球免疫層析試紙條、制備方法及檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

1、黃曲霉毒素(aflatoxin，af)是黃曲霉(aspergillus?flavus)和寄生曲霉(aspergillu?sparasiticus)的次級(jí)代謝產(chǎn)物，其種類繁多，目前已分離鑒定出12種以上，常見的有黃曲霉毒素b1、b2、g1、g2、m1、m2、b2a、g2a、bm2a和gm2a等，其中以黃曲霉毒素b1(aflatoxin?b1，afb1)分布最廣、毒性最強(qiáng)、危害最大。af的熱穩(wěn)定性非常好，280℃才可裂解，故常規(guī)加工溫度下難以破壞其分子結(jié)構(gòu)和致毒性。afb1是二氫呋喃氧雜萘鄰?fù)难苌铮浞肿咏Y(jié)構(gòu)中含有一個(gè)雙呋喃環(huán)和一個(gè)氧雜萘鄰?fù)?香豆素)，在已知的化學(xué)物質(zhì)中致癌力居首位，其急性毒性是氰化鉀的10倍，其慢性毒性可誘發(fā)癌變，致癌能力為二甲基亞硝胺的75倍。afb1對(duì)包括人和若干動(dòng)物具有強(qiáng)烈的毒性，其毒性作用主要是對(duì)肝臟的損害，人的原發(fā)性肝癌也很可能與之有關(guān)。afb1在天然食物和藥物中，特別是在干燥保存材料中的檢出率較高，國(guó)家質(zhì)檢總局規(guī)定afb1是大部分食品的必檢項(xiàng)目之一，《中國(guó)藥典》也規(guī)定afb1是動(dòng)物類、辛香類等多種中藥飲片的必檢項(xiàng)目之一。

2、目前，檢測(cè)afb1的方法有很多，常用的有薄層色譜法(tlc)、高效液相色譜法(hplc)、酶聯(lián)免疫法(elisa)、液質(zhì)聯(lián)用法(hplc-ms)等，這些方法的檢測(cè)時(shí)間大都比較長(zhǎng)，且需要特定的檢測(cè)設(shè)備，操作不便，檢測(cè)成本高，應(yīng)用范圍較為局限。免疫層析法因成本較低，且操作簡(jiǎn)單，常用于快速定性或半定量檢測(cè)，如促黃體激素、鹽酸克倫特羅和黃曲霉毒素等的膠體金試紙檢測(cè)方法。基于免疫層析技術(shù)的產(chǎn)品通常只需肉眼觀察或采用簡(jiǎn)單儀器就能快速獲得檢測(cè)結(jié)果，并且可以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，?？勺鳛榧膊』虬踩蜃?、雜質(zhì)檢測(cè)的初步篩選方法。因此，開發(fā)基于免疫層析技術(shù)的產(chǎn)品將有利于中藥飲片現(xiàn)場(chǎng)檢查或過程質(zhì)量控制。

3、免疫層析技術(shù)通過酶反應(yīng)或直接利用可目測(cè)的標(biāo)記物所顯示的直觀實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象而獲得測(cè)定結(jié)果，其中的標(biāo)記物有膠體金、乳膠、膠體硒、明膠等，而最常用的是膠體金。但是膠體金免疫層析技術(shù)受背景干擾大，易出現(xiàn)假陽性；其中膠體金與目標(biāo)蛋白以靜電吸附作用結(jié)合在一起，穩(wěn)定性差，容易出現(xiàn)假陰性；膠體金免疫層析技術(shù)檢測(cè)靈敏度較低，在實(shí)際檢測(cè)中只能用于定性或半定量檢測(cè)。

4、在免疫層析檢測(cè)技術(shù)中，除了采用膠體金作為標(biāo)記物外，己有相關(guān)專利報(bào)道了以熒光納米微粒為標(biāo)記物進(jìn)行免疫層析檢測(cè)，如公開號(hào)為cn1645146a的發(fā)明專利申請(qǐng)公開了一種用熒光稀土納米顆粒作為標(biāo)記物的免疫層析方法及其檢測(cè)試紙條的制備，該方法能提高免疫層析檢測(cè)的靈敏度，但該方法并未解決化學(xué)小分子抗原性弱的問題；公開號(hào)為cn116656688a和cn116590384a的發(fā)明專利申請(qǐng)分別公開了特異性識(shí)別afb1的適配體及其優(yōu)化方法，該方法避開了afb1抗原性問題，基于dna鏈反應(yīng)進(jìn)行標(biāo)記，但是afb1與單鏈dna結(jié)合的影響因素較多，檢測(cè)結(jié)果缺乏穩(wěn)定性，其應(yīng)用范圍受到限制。

5、本發(fā)明旨在提出一種檢測(cè)黃曲霉毒素b1的熒光微球免疫層析試紙條、制備方法及檢測(cè)方法，以期為中藥飲片等樣品中黃曲霉毒素b1的定量檢測(cè)提供新的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于，克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，提供一種檢測(cè)黃曲霉毒素b1的熒光微球免疫層析試紙條、制備方法及檢測(cè)方法，本發(fā)明的檢測(cè)黃曲霉毒素b1的熒光微球免疫層析試紙條，結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，制備實(shí)施可行性高，造價(jià)成本低，使用操作方便、快速，易于推廣普及，實(shí)用性好；熒光微球標(biāo)記的黃曲霉毒素b1抗體a為核殼結(jié)構(gòu)納米粒子，熒光微球作為核殼結(jié)構(gòu)納米粒子的內(nèi)核，不易受外界環(huán)境因素(例如溶液干擾)的影響，并且有助于增加熒光微球上熒光物質(zhì)所發(fā)射熒光強(qiáng)度的穩(wěn)定性和熒光壽命，從而擴(kuò)大了本發(fā)明熒光微球免疫層析試紙條可檢測(cè)適用的樣品范圍，相對(duì)于膠體金免疫層析技術(shù)，顯著提高了檢測(cè)結(jié)果的精準(zhǔn)度和可靠性，并且檢測(cè)靈敏度也大幅提高。本發(fā)明的一種使用熒光微球免疫層析試紙條定量檢測(cè)樣品中黃曲霉毒素b1的方法，操作簡(jiǎn)單，預(yù)先將一系列濃度的黃曲霉毒素b1標(biāo)準(zhǔn)品溶液對(duì)應(yīng)的黃曲霉毒素b1熒光強(qiáng)度-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線保存在熒光分析儀的分析軟件中，從而樣品供試溶液中黃曲霉毒素b1的濃度由熒光分析儀的分析軟件計(jì)算得到，顯著降低了人工計(jì)算勞動(dòng)量，并且有助于消除人為誤差因素，確保轉(zhuǎn)換得到的待測(cè)樣品中黃曲霉毒素b1含量結(jié)果數(shù)據(jù)可靠性高、精準(zhǔn)性好和穩(wěn)定性好。

2、本發(fā)明目的之一，設(shè)計(jì)一種檢測(cè)黃曲霉毒素b1的熒光微球免疫層析試紙條，包括底板，所述的底板上側(cè)面依次搭接地設(shè)置有濾紙、樣本墊、玻璃纖維膜、硝酸纖維素膜和吸水紙；

3、所述的玻璃纖維膜上附著有熒光微球標(biāo)記的黃曲霉毒素b1抗體a，熒光微球標(biāo)記的黃曲霉毒素b1抗體a為核殼結(jié)構(gòu)納米粒子，其中熒光微球作為核殼結(jié)構(gòu)納米粒子的內(nèi)核，黃曲霉毒素b1抗體a偶聯(lián)附著于熒光微球的外側(cè)面作為核殼結(jié)構(gòu)納米粒子的外殼；

4、所述的硝酸纖維素膜上設(shè)置有包被黃曲霉毒素b1抗體b的檢測(cè)線和包被有二抗或黃曲霉毒素b1合成抗原的質(zhì)控線。

5、優(yōu)選的技術(shù)方案是，所述的熒光微球由nahco3、k2s2o8、熒光物質(zhì)、苯乙烯于溶劑中反應(yīng)制得，其粒徑范圍為50～300nm；

6、所述的黃曲霉毒素b1抗體a于含有硼酸-四硼酸鈉-嗎啉乙磺酸的緩沖液體系中通過偶聯(lián)反應(yīng)附著于熒光微球的外側(cè)面，并經(jīng)大分子蛋白封閉。

7、進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案還有，所述的熒光物質(zhì)為羅丹明b甲酯、異硫氰酸羅丹明、異硫氰酸熒光素、熒光烷衍生物、6-梭基熒光素酞胺酷、香豆素類有機(jī)熒光染料或其摻雜物以及量子點(diǎn)中的一種或幾種，所述的大分子蛋白為牛血清白蛋白或卵清蛋白。

8、進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案還有，所述的底板為pvc板，所述的樣本墊為聚酯膜或玻璃纖維膜。

9、本發(fā)明目的之二，設(shè)計(jì)一種上述檢測(cè)黃曲霉毒素b1的熒光微球免疫層析試紙條的制備方法，包括如下操作步驟：

10、s1：稱取一定質(zhì)量的nahco3和k2s2o8溶于去離子水中，形成無機(jī)鹽水溶液；稱取一定質(zhì)量的熒光物質(zhì)溶于無水乙醇和苯乙烯的混合液中，形成含有熒光物質(zhì)的溶液；將含有熒光物質(zhì)的溶液加入制備好的無機(jī)鹽水溶液中，搖勻并向混合溶液體系中通入一定時(shí)間的氮?dú)?，然后置于一定溫度的恒溫水浴鍋中震搖反應(yīng)一定時(shí)間，取出并將離心分離得到的沉淀物用無水乙醇、去離子水洗滌數(shù)次，得熒光微球；

11、s2：稱取適量步驟s1制備的熒光微球，并與一定量的硼酸-四硼酸鈉緩沖液渦旋混勻，加入一定量的嗎啉乙磺酸緩沖液混合均勻，室溫震蕩一段時(shí)間后離心分離丟棄上清液，沉淀加入一定量的硼酸-四硼酸鈉緩沖液重懸，加入一定量的黃曲霉毒素b1抗體a，混合均勻，于室溫環(huán)境下偶聯(lián)反應(yīng)一段時(shí)間，然后加入一定量的大分子蛋白封閉反應(yīng)一段時(shí)間，離心分離丟棄上清液，沉淀中加入一定量的膠乳，混合均勻，得熒光微球標(biāo)記的黃曲霉毒素b1抗體a膠乳；

12、s3：將步驟s2制備的熒光微球標(biāo)記的黃曲霉毒素b1抗體a膠乳噴涂在玻璃纖維膜上，并干燥；

13、s4：將黃曲霉毒素b1抗體b包被到硝酸纖維素膜上形成檢測(cè)線，將二抗或黃曲霉毒素b1合成抗原包被到硝酸纖維素膜上形成質(zhì)控線；

14、s5：在底板上側(cè)面依次搭接地粘貼濾紙、樣本墊、玻璃纖維膜、硝酸纖維素膜和吸水紙，得到檢測(cè)黃曲霉毒素b1的熒光微球免疫層析試紙條。

15、優(yōu)選的技術(shù)方案還有，所述的步驟s1具體操作為：稱取20mg?nahco3和45mg?k2s2o8溶于35ml去離子水中，形成無機(jī)鹽水溶液；稱取一定質(zhì)量的熒光物質(zhì)溶于10ml無水乙醇和5ml苯乙烯的混合液中，形成含有熒光物質(zhì)的溶液；將含有熒光物質(zhì)的溶液加入制備好的無機(jī)鹽水溶液中，搖勻并向混合溶液體系中通入5～10min的氮?dú)猓缓笾糜?0～80℃的恒溫水浴鍋中震搖反應(yīng)24h后取出，并于10000rpm轉(zhuǎn)速條件下離心分離丟棄上清液，將沉淀物依次分別用無水乙醇、去離子水洗滌3次，得熒光微球；

16、所述的步驟s2具體操作為：稱取1mg步驟s1制備的熒光微球，并加入400ul硼酸-四硼酸鈉緩沖液渦旋混勻，加入600ul嗎啉乙磺酸緩沖液混合均勻，室溫震蕩0.5～1h后，并于12000rpm轉(zhuǎn)速條件下離心分離丟棄上清液，沉淀加入400ul硼酸-四硼酸鈉緩沖液重懸，加入一定量的黃曲霉毒素b1抗體a混合均勻，其中黃曲霉毒素b1抗體a的含量為100ug/ml，于室溫環(huán)境下偶聯(lián)反應(yīng)3h，然后加入400ul大分子蛋白溶液封閉反應(yīng)一段時(shí)間，離心分離丟棄上清液，沉淀中加入10ml的膠乳，混合均勻，得熒光微球標(biāo)記的黃曲霉毒素b1抗體a膠乳，其中大分子蛋白溶液中溶質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％；

17、所述的步驟s3具體操作為：用biodot?dispensing?system將步驟s2制備的熒光微球標(biāo)記的黃曲霉毒素b1抗體a膠乳噴涂在玻璃纖維膜上，其中熒光微球標(biāo)記的黃曲霉毒素b1抗體a的噴涂量為4ul/cm，并于25℃真空環(huán)境干燥2h；

18、所述的步驟s4中：黃曲霉毒素b1抗體b、二抗或黃曲霉毒素b1合成抗原的包被濃度均為0.6～0.8mg/ml，噴涂量均為0.6～0.8ul/cm。

19、進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案還有，所述的步驟s2中，硼酸-四硼酸鈉緩沖液的ph＝8.0，嗎啉乙磺酸緩沖液的ph＝6.0。

20、本發(fā)明目的之三，設(shè)計(jì)一種使用熒光微球免疫層析試紙條定量檢測(cè)樣品中黃曲霉毒素b1的方法，所用的熒光微球免疫層析試紙條為上述的檢測(cè)黃曲霉毒素b1的熒光微球免疫層析試紙條，包括如下操作步驟：

21、h1：繪制黃曲霉毒素b1的標(biāo)準(zhǔn)曲線：配制一系列濃度的黃曲霉毒素b1標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用同一批次的若干檢測(cè)黃曲霉毒素b1的熒光微球免疫層析試紙條一一對(duì)應(yīng)檢測(cè)每一個(gè)濃度黃曲霉毒素b1標(biāo)準(zhǔn)品溶液的熒光強(qiáng)度，并以對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)、黃曲霉毒素b1標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度為橫坐標(biāo)繪制一條黃曲霉毒素b1熒光強(qiáng)度-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，并保存在熒光分析儀的分析軟件系統(tǒng)中；

22、h2：將待測(cè)樣品中浸提出疑似含有黃曲霉毒素b1成分的樣液，并將樣液置于容量瓶中定量配制為樣品供試溶液；

23、h3：取適量步驟h2所制備的樣品供試溶液滴加到檢測(cè)黃曲霉毒素b1的熒光微球免疫層析試紙條的樣本墊上，室溫下孵育10～15min，然后將檢測(cè)黃曲霉毒素b1的熒光微球免疫層析試紙條置于熒光分析儀中測(cè)試檢測(cè)線和質(zhì)控線的熒光強(qiáng)度，通過熒光分析儀的分析軟件系統(tǒng)自動(dòng)計(jì)算獲得質(zhì)控線位置的熒光強(qiáng)度校正系數(shù)z，然后將檢測(cè)線位置的熒光強(qiáng)度和熒光強(qiáng)度校正系數(shù)z代入保存在熒光分析儀的分析軟件系統(tǒng)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線公式中，計(jì)算得出樣品供試溶液中黃曲霉毒素b1的濃度，進(jìn)而轉(zhuǎn)換得出待測(cè)樣品中黃曲霉毒素b1的含量。

24、本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果在于：

25、1、本發(fā)明的一種檢測(cè)黃曲霉毒素b1的熒光微球免疫層析試紙條，結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，制備實(shí)施可行性高，造價(jià)成本低，使用操作方便、快速，易于推廣普及，實(shí)用性好；熒光微球標(biāo)記的黃曲霉毒素b1抗體a為核殼結(jié)構(gòu)納米粒子，熒光微球作為核殼結(jié)構(gòu)納米粒子的內(nèi)核，不易受外界環(huán)境因素(例如溶液干擾)的影響，并且有助于增加熒光微球上熒光物質(zhì)所發(fā)射熒光強(qiáng)度的穩(wěn)定性和熒光壽命，從而擴(kuò)大了本發(fā)明熒光微球免疫層析試紙條可檢測(cè)適用的樣品范圍，相對(duì)于膠體金免疫層析技術(shù)，顯著提高了檢測(cè)結(jié)果的精準(zhǔn)度和可靠性，并且檢測(cè)靈敏度也大幅提高。

26、2、本發(fā)明的一種檢測(cè)黃曲霉毒素b1的熒光微球免疫層析試紙條的制備方法，操作步驟簡(jiǎn)單，制備實(shí)施可行性高，實(shí)用性強(qiáng)。

27、3、本發(fā)明的一種使用熒光微球免疫層析試紙條定量檢測(cè)樣品中黃曲霉毒素b1的方法，操作簡(jiǎn)單，預(yù)先將一系列濃度的黃曲霉毒素b1標(biāo)準(zhǔn)品溶液對(duì)應(yīng)的黃曲霉毒素b1熒光強(qiáng)度-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線保存在熒光分析儀的分析軟件中，從而樣品供試溶液中黃曲霉毒素b1的濃度由熒光分析儀的分析軟件計(jì)算得到，顯著降低了人工計(jì)算勞動(dòng)量，并且有助于消除人為誤差因素，確保轉(zhuǎn)換得到的待測(cè)樣品中黃曲霉毒素b1含量結(jié)果數(shù)據(jù)可靠性高、精準(zhǔn)性好和穩(wěn)定性好。