本發(fā)明屬于生物檢測(cè)領(lǐng)域,具體涉及一種基于納米復(fù)合材料和量子點(diǎn)構(gòu)建雙信號(hào)適配體傳感器檢測(cè)gp73的方法。
背景技術(shù):
1、原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hcc)是全球五大癌癥之一,對(duì)生命健康威脅巨大。高爾基體蛋白73(gp73)是一種新型肝癌標(biāo)志物,檢測(cè)方法主要有放射免疫分析法、熒光免疫分析法、電化學(xué)免疫傳感器、壓電免疫傳感器等。公開號(hào)cn?111413502a的發(fā)明專利,涉及一種采用商業(yè)elisa試劑盒血清檢測(cè)gp73的方法;公開號(hào)cn?113945713a的發(fā)明專利,涉及一種利用新型生物芯片檢測(cè)gp73等腫瘤標(biāo)記物的方法,滿足了大規(guī)模樣本檢測(cè)的需求。但仍存在gp73檢測(cè)靈敏度低、操作復(fù)雜、成本高等缺點(diǎn)。因此,需要一種快速靈敏、操作簡(jiǎn)單的gp73檢測(cè)方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種基于氮硫摻雜還原氧化石墨烯-氯化血紅素-二硫化鉬(nsrgo-h-mos2)納米復(fù)合材料,結(jié)合gp73適配體1(gp73apt1)形成信號(hào)探針(nsrgo-h-mos2-gp73apt1);硼氮摻雜量子點(diǎn)(bncqd)結(jié)合gp73適配體2(gp73apt2)形成捕獲探針(gp73apt2-bncqd),構(gòu)建高靈敏夾心型雙信號(hào)電化學(xué)傳感器來(lái)檢測(cè)gp73的方法,該方法的最低檢測(cè)限為0.88pg/ml和1.09pg/ml。
2、本發(fā)明的檢測(cè)原理為:利用脫水縮合、π-π鍵吸附作用,成功合成具有高比表面積、高電導(dǎo)率的納米復(fù)合材料,并通過(guò)π-π鍵作用將nsrgo-h-mos2納米復(fù)合材料與gp73apt1結(jié)合,形成與gp73特異性結(jié)合的nsrgo-h-mos2-gp73apt1;采用電沉積技術(shù)將金納米粒子(au?nps)修飾在絲網(wǎng)印刷電極(spce)表面;通過(guò)au-sh鍵作用將gp73apt2-bncqd負(fù)載在修飾au?nps的電極表面;最后將gp73和nsrgo-h-mos2-gp73apt1先后孵育在上述電極表面,由于gp73能夠與gp73apt1、gp73apt2特異性結(jié)合,有序排列在電極表面,形成srgo-h-mos2-gp73apt1/gp73/gp73apt2-bncqd夾心型結(jié)構(gòu),從而構(gòu)建了gp73夾心型電化學(xué)適配體傳感器。bncqd能增強(qiáng)電極表面導(dǎo)電性,nsrgo-h-mos2具有出色的類過(guò)氧化物酶性質(zhì)能催化過(guò)氧化氫(h2o2)將3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(tmb)氧化為氧化物tmb(oxtmb),通過(guò)方波伏安法(swv)記錄nsrgo-h-mos2中hemin與tmb各自的氧化峰電流變化值,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)gp73的雙信號(hào)檢測(cè)。
3、為了解決該技術(shù)問(wèn)題,本發(fā)明按照以下步驟進(jìn)行:
4、步驟1:nsrgo-h-mos2-gp73apt1信號(hào)探針的制備
5、(1)氮硫摻雜還原氧化石墨烯(nsrgo)的制備:往純水中加入氧化石墨烯(go),超聲破碎后得到go溶液;向go溶液中加入尿素(ch4n2o)和硫脲(ch4n2s),進(jìn)行水熱反應(yīng);離心,洗滌;得到nsrgo溶液。
6、(2)氮硫摻雜還原氧化石墨烯-氯化血紅素(nsrgo-h)的制備:用氨水溶解氯化血紅素(hemin),再加入至nsrgo溶液中進(jìn)行攪拌;離心,洗滌;得到nsrgo-h溶液。
7、(3)氨基化二硫化鉬(mos2-nh2)的制備:將二硫化鉬(mos2)和β-巰基乙胺氨溶解至n,n-二甲基甲酰胺(dmf),攪拌;離心,洗滌;得到mos2-nh2溶液。
8、(4)氮硫摻雜還原氧化石墨烯-氯化血紅素-二硫化鉬(nsrgo-h-mos2)的制備:將mos2-nh2溶液與nsrgo-h溶液混合,離心,去除上清液,得到nsrgo-h-mos2溶液。
9、(5)氮硫摻雜還原氧化石墨烯-氯化血紅素-二硫化鉬-gp73適配體1(nsrgo-h-mos2-gp73apt1)信號(hào)探針的制備:將gp73適配體1(gp73apt1)溶液和nsrgo-h-mos2溶液超聲均勻混合,孵育,離心,洗滌;得到nsrgo-h-mos2-gp73apt1信號(hào)探針。
10、步驟2:gp73apt2-bncqd捕獲探針的制備
11、(1)硼氮摻雜量子點(diǎn)(bncqd)的制備:往純水中加入一水檸檬酸(c6h8o7·h2o)和硼酸(h3bo3),混合均勻;向溶液中加入一水乙二胺(c2h8n2·h2o),攪拌后轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜,進(jìn)行水熱反應(yīng);透析;得到bncqd溶液。
12、(2)gp73適配體2-硼氮摻雜量子點(diǎn)(gp73apt2-bncqd)捕獲探針的制備:將適配體2(gp73apt2)溶液和bncqd溶液超聲均勻混合,孵育;離心,洗滌,得gp73apt2-bncqd捕獲探針。
13、步驟3:電極的修飾與傳感界面的構(gòu)建
14、(1)au?nps/spce的制備:將絲網(wǎng)印刷電極(spce)置于稀h2so4溶液中采用循環(huán)伏安法(cv)活化;再將活化后的spce置入氯金酸(haucl4)溶液中,利用計(jì)時(shí)電流法(i-t)進(jìn)行恒電位沉積,得aunps/spce電極。
15、(2)gp73apt2-bncqd/au?nps/spce傳感界面的制備:滴加gp73apt2-bncqd溶液在aunps/spce表面孵育,再用牛血清蛋白(bsa)溶液封閉活性位點(diǎn),得到gp73apt2-bncqd/aunps/spce電化學(xué)傳感界面。
16、步驟4:gp73工作曲線的繪制
17、(1)將不同濃度的gp73標(biāo)準(zhǔn)液滴加在步驟3中得到的電化學(xué)生物傳感界面,孵育、清洗、吹干,得gp73/gp73apt2-bncqd/au?nps/spce;
18、(2)在gp73/gp73apt2-bncqd/au?nps/spce上滴加nsrgo-h-mos2-gp73apt1溶液,孵育、清洗、吹干,得到nsrgo-h-mos2-gp73apt1/gp73/gp73apt2-bncqd/au?nps/spce。然后將工作電極浸入含有h2o2和tmb的磷酸緩沖鹽(pbs)溶液中,采用電化學(xué)工作站的swv掃描,記錄雙信號(hào)傳感器的響應(yīng)電流。
19、(3)檢測(cè)不同濃度的gp73,記錄電流峰值,根據(jù)不同濃度下的兩個(gè)信號(hào)電流峰值與gp73濃度的關(guān)系,繪制gp73工作曲線,計(jì)算該方法對(duì)應(yīng)的兩個(gè)最低檢測(cè)限。
20、步驟5:實(shí)際血清樣本中g(shù)p73的檢測(cè)
21、(1)先將實(shí)際血清樣本稀釋,在步驟3得到的gp73apt2-bncqd/aunps/spce傳感界面,滴加待測(cè)實(shí)際樣品,再滴加nsrgo-h-mos2-gp73apt1信號(hào)探針,孵育、洗滌晾干,得到工作電極。將所制備的工作電極浸入pbs溶液中,采用電化學(xué)工作站的swv掃描,記錄雙信號(hào)傳感器的響應(yīng)電流值。
22、(2)根據(jù)步驟4所得到的工作曲線,計(jì)算得到所述待測(cè)實(shí)際血清樣本中g(shù)p73的濃度。
23、作為優(yōu)選:
24、步驟1所述,水熱反應(yīng)制備nsrgo的反應(yīng)溫度為180℃,反應(yīng)時(shí)間為12h;gp73apt1的dna序列為5′-nh2-c6-gcagttgatcctttggataccctgg-3′;
25、步驟2所述gp73apt2的dna序列為5'-sh-acgctcggatgccactacag-ttggtttttttttgttatttagagtaaa?aaccttgtgtgtagtga-ctcatggacgtgctggtgac-3';
26、所述步驟3中稀h2so4溶液的濃度為0.5mol/l,cv掃描電壓為-1.2v~1.2v,haucl4溶液濃度為0.01%,恒電壓為-0.5v,掃描時(shí)間為2min;
27、所述步驟3、步驟4中滴在電極表面的gp73apt2-bncqd和nsrgo-h-mos2-gp73apt1的用量均為2.5μl;
28、步驟4、步驟5中swv掃描,電壓范圍-0.4v~0.8v,所述電極的孵育溫度為25℃,孵育時(shí)間為40min,pbs緩沖液ph值為5.5,tmb:h2o2體積比為2:1,信號(hào)探針濃度為0.6mg/ml,捕獲探針時(shí)濃度為0.4mg/ml,傳感器的空白響應(yīng)電流最大。
29、其中,步驟1合成具有高電活性和大比表面的nsrgo-h-mos2,與gp73apt1通過(guò)π-π結(jié)合形成了nsrgo-h-mos2-gp73apt1信號(hào)探針。步驟2中合成具有高導(dǎo)電性bncqd,與gp73apt2通過(guò)π-π結(jié)合形成了gp73apt2-bncqd捕獲探針。步驟3形成gp73apt2-bncqd/aunps/spce傳感界面。步驟1中信號(hào)探針不僅為步驟4和步驟5提供pbs中tmb的氧化信號(hào),還提供nsrgo-h-mos2中hemin的氧化信號(hào)。步驟4的gp73雙信號(hào)工作曲線為步驟5的實(shí)際血清樣本中g(shù)p73濃度的測(cè)定提供計(jì)算依據(jù)??梢?jiàn)步驟1-5相互支撐,共同作用,才能利用基于nsrgo-h-mos2納米復(fù)合材料和bncqd的電化學(xué)適配體雙信號(hào)傳感器實(shí)現(xiàn)對(duì)gp73的檢測(cè)。
30、本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn):
31、1.本方法首先制備了具有獨(dú)特形貌的nsrgo-h-mos2納米復(fù)合材料,具有大的比表面積、高電活性、優(yōu)異的電子轉(zhuǎn)移速率和類過(guò)氧化物酶性質(zhì);并成功制備了nsrgo-h-mos2-gp73apt1信號(hào)探針,能夠特異性識(shí)別gp73蛋白。
32、2.采用gp73apt2-bncqd捕獲探針修飾電極表面不僅可以有效固定gp73apt2,而且提高傳感器導(dǎo)電性能,增強(qiáng)電子之間的轉(zhuǎn)移效率,有效放大檢測(cè)的電流信號(hào)。
33、3.利用nsrgo-h-mos2類過(guò)氧化物酶性質(zhì)催化h2o2釋放羥基自由基氧化tmb為oxtmb,以nsrgo-h-mos2納米復(fù)合材料中的hemin作為電活性物質(zhì),在swv掃描時(shí)hemin中fe(ⅱ)氧化為fe(iii),構(gòu)建夾心型電化學(xué)適配體傳感器,用以檢測(cè)gp73。夾心型結(jié)構(gòu)更穩(wěn)固且精度更高,記錄tmb和hemin的氧化峰電流值,繪制雙信號(hào)傳感器的電流值和gp73濃度的關(guān)系曲線,兩個(gè)信號(hào)可以相互佐證,提高準(zhǔn)確性,實(shí)現(xiàn)對(duì)gp73的定量檢測(cè)。