本發(fā)明涉及基于ldha功能的生物標(biāo)志物在腫瘤診斷中的應(yīng)用，屬于腫瘤醫(yī)藥領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

1、腫瘤治療關(guān)鍵在于是否能做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷，以便采取相應(yīng)的治療措施，目前腫瘤只有爭(zhēng)取早期治療，才有可能被徹底治愈，如果腫瘤發(fā)展到中、晚期，腫瘤組織擴(kuò)大或已發(fā)生轉(zhuǎn)移，即使采取了各種治療手段也很難根治；相反，如果在早期或相對(duì)早期以及發(fā)生轉(zhuǎn)移之前就能發(fā)現(xiàn)腫瘤并及時(shí)給予合理治療，相當(dāng)部分的病人能取得滿意的治療效果，甚至可達(dá)到根治效果。

2、目前腫瘤診斷的方法分為5級(jí)：①臨床診斷：根據(jù)臨床癥狀、體征以及影像學(xué)檢查，參考疾病發(fā)展規(guī)律做出的推測(cè)診斷；②手術(shù)診斷：經(jīng)手術(shù)或各種內(nèi)鏡檢查，僅以肉眼看到的腫物而做出的判斷，未經(jīng)病理學(xué)證實(shí)；③理化診斷：在臨床上符合癌癥表現(xiàn)，并有理化檢查陽(yáng)性結(jié)果支持，如x線、b超、ct和mri核磁共振檢查，或癌胚抗原、甲胎蛋白測(cè)定等；④細(xì)胞病理學(xué)診斷：根據(jù)各種脫落細(xì)胞、穿刺細(xì)胞檢查而做出的診斷；⑤組織病理學(xué)診斷：經(jīng)粗針穿刺后獲得的組織，制成病理切片，進(jìn)行病理分析后得到的診斷。在這5級(jí)中，其診斷的可靠性依次增加，以第五級(jí)最為理想。但上述方法無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的早發(fā)現(xiàn)和早診斷，更多的是在腫瘤發(fā)展到一定程度后，甚至患者出現(xiàn)嚴(yán)重的病狀體征，此時(shí)往往會(huì)錯(cuò)失最佳治療時(shí)期，使后期治療處于極大的被動(dòng)狀態(tài)，并且，診斷效果較好的病理學(xué)診斷需要穿刺取細(xì)胞或組織切片，對(duì)患者的精神和身體存在較大損害和消極影響。找到更加有效的生物標(biāo)志物，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的早期診斷，至關(guān)重要。

3、目前對(duì)于肝癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究尚存在很多不足，嚴(yán)重阻礙了對(duì)于這類腫瘤的診治新手段的開(kāi)發(fā)。乳酸脫氫酶a(ldha)是一種關(guān)鍵的糖酵解酶，在糖酵解的最后一步催化丙酮酸鹽轉(zhuǎn)化為乳酸鹽。糖酵解產(chǎn)生的乳酸作為組蛋白或非組蛋白乳酸化的底物，以糖酵解依賴的方式調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞和癌癥細(xì)胞中的基因表達(dá)和蛋白質(zhì)活性。盡管在糖酵解中發(fā)現(xiàn)了ldha的關(guān)鍵代謝功能，但其在免疫治療過(guò)程中對(duì)脫鐵性貧血和腫瘤發(fā)展起關(guān)鍵作用的潛在功能仍不清楚。鐵死亡是一種不同形式的調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡，依賴于鐵的積累，并由細(xì)胞膜內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化物的增加驅(qū)動(dòng)。它在癌癥的發(fā)展和免疫治療中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

4、鑒于上述背景，為了更準(zhǔn)確地判斷腫瘤發(fā)展、更合理地選擇治療方案，從而提高腫瘤免疫治療的效果，有必要尋找與腫瘤細(xì)胞鐵死亡和免疫逃逸機(jī)制相關(guān)的關(guān)鍵標(biāo)志物，以用于對(duì)腫瘤進(jìn)行早期診斷。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題或首要目的是，對(duì)受試者患腫瘤的情況進(jìn)行早期診斷。

2、本發(fā)明的再一個(gè)目的是，提供用于所述早期診斷的產(chǎn)品。

3、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

4、第一方面，本發(fā)明將ldha的修飾形式ldha?s319磷酸化作為生物標(biāo)志物，應(yīng)用于制備腫瘤診斷試劑。

5、本發(fā)明的方案中，ldha?s319磷酸化指的是ldha的氨基酸序列319位發(fā)生磷酸化；ldha的ncbi序列號(hào)：np_005557.1。

6、本發(fā)明所述的方案中，通過(guò)使用針對(duì)ldha?s319磷酸化的免疫檢測(cè)試劑檢測(cè)來(lái)自受試者的樣本中l(wèi)dha?s319磷酸化的表達(dá)水平，即可對(duì)受試者患癌情況進(jìn)行早期診斷。進(jìn)一步地，所述的來(lái)自受試者的樣本是受試者的靜脈外周血、癌旁組織或腫瘤組織中的任意一種。

7、本發(fā)明所述的應(yīng)用中，所述的腫瘤診斷試劑是基于elisa或westernblot方法的免疫檢測(cè)試劑。。

8、第二方面，本發(fā)明還提供一種抗體，所述的抗體是能夠特異性結(jié)合ldha?s319磷酸化的抗體。

9、第三方面，本發(fā)明還提供一種可定量或半定量檢測(cè)蛋白質(zhì)的試劑盒，內(nèi)含本發(fā)明第二方面所述的抗體。

10、本發(fā)明優(yōu)選的方案中，所述的可定量或半定量檢測(cè)蛋白質(zhì)的試劑盒是可通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(elisa)方法或免疫印跡(westernblot)方法檢測(cè)蛋白質(zhì)的試劑盒；所述的試劑盒內(nèi)有第一抗體和第二抗體；所述的第一抗體是能夠特異性結(jié)合ldha?s319磷酸化的抗體，所述的第二抗體為與所述第一抗體同源的酶標(biāo)記抗體。

11、第四方面，本發(fā)明還提供特異性結(jié)合所述ldha?s319磷酸化的抗體在制備腫瘤診斷試劑盒中的應(yīng)用。

12、本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的方案中，所述的試劑盒內(nèi)還有選自下組的一種或多種物質(zhì)：容器、使用說(shuō)明書(shū)、陽(yáng)性對(duì)照物、陰性對(duì)照物、緩沖劑、助劑或溶劑。其中，使用說(shuō)明書(shū)記載了如何采用試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，和如何利用檢測(cè)結(jié)果對(duì)腫瘤發(fā)展進(jìn)行判斷、對(duì)治療方案進(jìn)行選擇。試劑盒的組分可以水介質(zhì)的形式或以凍干的形式來(lái)包裝。

13、本發(fā)明所述的腫瘤診斷試劑盒可以用于以下任意一種腫瘤疾病的早期、中期或晚期的診斷：口腔癌、口咽癌、鼻咽癌、呼吸系統(tǒng)癌癥、泌尿生殖系統(tǒng)癌癥、胃腸癌、中樞或周圍神經(jīng)系統(tǒng)組織癌、內(nèi)分泌或神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)癌癥、造血系統(tǒng)癌癥、膠質(zhì)瘤、肉瘤、上皮癌、淋巴瘤、黑素瘤、纖維瘤、腦脊膜瘤、腦癌、腎癌、膽道系統(tǒng)癌癥、嗜鉻細(xì)胞瘤、胰島細(xì)胞癌、利-弗勞梅尼瘤、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、垂體瘤、腎上腺瘤、骨源性肉瘤腫瘤、神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)腫瘤、乳腺癌、肺癌、頭頸癌、前列腺癌、食管癌、氣管癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、子宮癌、宮頸癌、睪丸癌、結(jié)腸癌、直腸癌或皮膚癌。

14、本發(fā)明提出了一種新的生物標(biāo)志物ldha?s319磷酸化在腫瘤診斷中的應(yīng)用。通過(guò)檢測(cè)該生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，可以在早期、中期或晚期對(duì)受試者患腫瘤的情況進(jìn)行診斷。

15、本發(fā)明所述的ldha?s319磷酸化作為ldha的一種特定修飾形式，與腫瘤細(xì)胞的鐵死亡及免疫逃逸機(jī)制高度相關(guān)，并通過(guò)非代謝功能誘導(dǎo)癌細(xì)胞的免疫逃逸。具體來(lái)講，前期研究中，發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)肝癌接受pd-1免疫治療時(shí)，cd8+t細(xì)胞分泌的ifnγ能夠活化s6k，觸發(fā)活化的s6k磷酸化ldha的s319位點(diǎn)，ldha的這種磷酸化能夠抑制肝癌細(xì)胞鐵死亡，從而降低了肝癌的pd-1免疫治療效果。此外，在肝癌臨床標(biāo)本中，ldha?s319磷酸化水平與鐵死亡的標(biāo)志物4-hne的表達(dá)呈正相關(guān)，與肝癌患者的不良預(yù)后相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)揭示了肝癌細(xì)胞在接受pd-1免疫治療時(shí)，ifnγ通過(guò)誘導(dǎo)ldha?s319磷酸化抑制肝癌細(xì)胞鐵死亡的非代謝功能來(lái)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的免疫逃逸的關(guān)鍵機(jī)制，并強(qiáng)調(diào)了靶向ldha?s319磷酸化和抗pd-1抗體的聯(lián)合治療是一種很有前途的hcc免疫療法。

16、上述發(fā)現(xiàn)具體通過(guò)以下研究得到：

17、1材料和方法

18、1.1使用材料

19、(1)細(xì)胞種類：huh7細(xì)胞(人肝癌細(xì)胞株huh7細(xì)胞)、bel-7405細(xì)胞(人肝癌細(xì)胞株hep3b細(xì)胞)，來(lái)自atcc；

20、(2)無(wú)胸腺裸鼠是balb/c無(wú)胸腺裸鼠；

21、(3)病人樣本：從浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院(中國(guó)杭州)的生物庫(kù)中回顧性收集了經(jīng)手術(shù)切除、福爾馬林固定、石蠟包埋的hcc組織樣品。選擇100例經(jīng)病理診斷為肝癌的未接受過(guò)手術(shù)治療的患者的組織樣本作為獨(dú)立隊(duì)列。通過(guò)回顧患者的病史獲得了臨床數(shù)據(jù)。病理分期由美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)/國(guó)際癌癥控制tnm分類系統(tǒng)聯(lián)合會(huì)第8版評(píng)估。

22、(4)基因敲降所用shrna序列如下：

23、ldhashrna:5′-gcaaactccaagctggtcatt-3′；

24、s6kshrna:5′-cccatgatctccaaacggcca-3′。

25、1.2試驗(yàn)方法

26、(1)磷酸化蛋白質(zhì)的水平檢測(cè)：

27、通過(guò)使樣品與特異性結(jié)合磷酸化多肽的抗體接觸并確定結(jié)合的抗體的量，例如通過(guò)檢測(cè)或測(cè)量抗體與多肽之間復(fù)合物的行程?？贵w可被標(biāo)記(放射性、熒光等)以便于檢測(cè)復(fù)合物。

28、用于本發(fā)明的多肽水平的檢測(cè)系統(tǒng)包括：放射自顯影免疫測(cè)定ria、免疫熒光、凝膠電泳、western免疫印跡測(cè)定。

29、所用抗體(添加)：抗flag(14793s)用于ip)、ldha(3582s)、s6k?pt389(9234s)(用于wb)、ub(43124s)、ha(3724s)(用于ip)、tyk2?py1054/1055(68790)、tyk2(14193)、jak2py1007/1008(3771)、jak2(3230)、stat3?py705(9145)、stat3(9139)、flag(f1804)(用于wb)、his(sab1305538)、4-hne(bs-6313r)gst(sc-138)、tubulin(sc-8035)購(gòu)自cst，ldhaps319特異性抗體由abclonal公司合成。

30、小鼠腫瘤樣品獲取與分析：6周大的雄性免疫活性小鼠被安置在無(wú)特定病原體的條件下，光照周期為14小時(shí)/10小時(shí)，環(huán)境溫度為21-23℃，濕度為50％，可以隨意獲得水和食物。將表達(dá)熒光素酶的hep1-6細(xì)胞(3×105)懸浮在20μl的pbs中并直接注射到肝臟中，或懸浮在50μl的pbs中并皮下注射到6周齡雄性免疫活性小鼠皮下，從第2天起注射或不注射anti-pd-1。對(duì)于anti-pd-1阻斷，每只小鼠每3天腹膜內(nèi)接受200μg的anti-pd-1抗體或?qū)φ読gg2a。原位癌癥的生物發(fā)光成像使用ivis系統(tǒng)(aniview?100，biolight?biotechnology，guangzhou，china)進(jìn)行。隨后，對(duì)動(dòng)物實(shí)施安樂(lè)死，解剖每只小鼠的腫瘤，固定在4％甲醛中，并包埋在石蠟中。通過(guò)蘇木精和伊紅染色切片的組織學(xué)分析來(lái)評(píng)估腫瘤的形成和表型。使用公式v＝1/2a2b計(jì)算腫瘤體積(其中v是體積，a是最短直徑，b是最長(zhǎng)直徑)。

31、(6)免疫組化：石蠟包埋的人肝癌樣品切片用特異性一級(jí)抗體以及非特異性igg作為陰性對(duì)照進(jìn)行染色。具體方法為：將石蠟切片去石蠟，再水化和抗原修復(fù)后，將tma玻片與一抗兔抗人磷酸化ldha?s319(稀釋度1：200)或非特異性igg(作為陰性對(duì)照)在4℃過(guò)夜。然后將玻片與抗兔二抗(即用型溶液；cellsignalingtechnology；#8114)孵育，然后進(jìn)行二原色二氨基聯(lián)苯胺(dab)染色(cellsignalingtechnology)和蘇木精染色，并在二甲苯上固定。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞的百分比和染色強(qiáng)度在顯微鏡下對(duì)組織玻片進(jìn)行定量評(píng)分。本發(fā)明分配了以下陽(yáng)性細(xì)胞比例得分：0分，0％的細(xì)胞為陽(yáng)性；1分，0％至1％的細(xì)胞為陽(yáng)性；2分，2％至10％的細(xì)胞為陽(yáng)性；3分，11％至30％的細(xì)胞為陽(yáng)性；4分，31％至70％的細(xì)胞為陽(yáng)性；和5分，從71％到100％的細(xì)胞為陽(yáng)性。還以0到3的等級(jí)對(duì)染色強(qiáng)度進(jìn)行了評(píng)級(jí)：0級(jí)，陰性(即沒(méi)有可見(jiàn)的染色)；1級(jí)，弱(非常淺的顏色)；2級(jí)，適中(顏色明顯)；3級(jí)，強(qiáng)(顏色非常深)。如前所述文獻(xiàn)記載將陽(yáng)性細(xì)胞比例得分和染色強(qiáng)度等級(jí)相加以獲得總得分(范圍0-8)。兩位不了解臨床信息的病理學(xué)家獨(dú)立地驗(yàn)證了評(píng)分系統(tǒng)的可重復(fù)性。

32、(7)患者的總生存率kaplan-meier繪圖使用spss20.0版軟件(spssinc.，美國(guó)伊利諾伊州，芝加哥)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較了生物標(biāo)志物在腫瘤和正常組織中的表達(dá)水平。使用單因素方差分析(anova，posthocbonferroni檢驗(yàn))對(duì)生物標(biāo)志物的表達(dá)水平與患者的臨床病理特征之間的相關(guān)性進(jìn)行多重比較和最低顯著性差異檢驗(yàn)。使用pearson相關(guān)系數(shù)分析生物標(biāo)志物表達(dá)水平之間的相關(guān)性?？偵嫫?os)定義為從診斷之日至死亡之日或最后一次隨訪的持續(xù)時(shí)間。使用k-means聚類分析對(duì)相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)水平進(jìn)行分類、kaplan-meier方法繪制生存曲線、對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)以比較生存率以及帶有雙向wald檢驗(yàn)的cox回歸模型計(jì)算危險(xiǎn)比(hr)和95％置信區(qū)間(cis)進(jìn)行生存分析。審查的數(shù)據(jù)用于上次隨訪中活著或因隨訪而遺失的患者。p值小于0.05的單變量分析變量納入多變量分析。p<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)都是雙面的。

33、2結(jié)果與分析

34、(1)如圖1所示，huh7細(xì)胞ifnγ處理12小時(shí)后，免疫結(jié)果分析表明ifnγ能夠誘導(dǎo)ldha與s6k相互作用。

35、(2)如圖2所示，co-ip聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)ifnγ處理后的huh7細(xì)胞中的ldha位點(diǎn)能夠發(fā)生磷酸化修飾。

36、(3)如圖3所示，ldha?s319位點(diǎn)失活突變后，ldha無(wú)法被s6k磷酸化。

37、(4)如圖4所示，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ldha磷酸化位點(diǎn)s319a突變和酶失活k155r位點(diǎn)突變誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化。

38、(5)如圖5所示，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ldha磷酸化位點(diǎn)s319a突變和酶失活k155r位點(diǎn)突變誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。

39、(6)如圖6所示，細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ldha磷酸化位點(diǎn)s319a突變和酶失活k155r位點(diǎn)突變抑制細(xì)胞增殖。

40、(7)ldha磷酸化位點(diǎn)s319a突變能夠增加移植瘤對(duì)anti-pd-1治療的敏感性。將hep1-6-luc細(xì)胞原位注射到6周齡的雄性免疫活性小鼠中，同時(shí)用anti-pd-1進(jìn)行治療，結(jié)果表達(dá)ldha?s319位點(diǎn)磷酸化能夠降低移植瘤對(duì)anti-pd-1治療的敏感性，ldha?s319a突變能夠增加移植瘤對(duì)anti-pd-1治療的敏感性(圖7a、圖7b、圖8a和圖8b)，免疫組化實(shí)驗(yàn)表明ldha?s319a位點(diǎn)突變能夠促進(jìn)鐵死亡，提高pd-1免疫治療效果(圖9)。

41、(8)ldha?s319磷酸化與肝癌患者的預(yù)后相關(guān)。我們使用經(jīng)驗(yàn)證的抗ldha-ps319的免疫組化染色分析了人類原發(fā)性肝癌標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)肝癌組織中這些蛋白質(zhì)標(biāo)記物的水平明顯高于癌旁組織(圖10)。此外，觀察到ldha-ps319與鐵死亡標(biāo)志物4-hne表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(圖11)。再有，ldhas319的磷酸化與肝癌患者的不良生存結(jié)果呈正相關(guān)(圖12)。

42、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：1、本發(fā)明基于腫瘤代謝的機(jī)理，找到了針對(duì)腫瘤代謝的新的生物標(biāo)志物，通過(guò)檢測(cè)生物標(biāo)志物表達(dá)水平可以實(shí)現(xiàn)腫瘤的早期診斷；2、樣品采集靜脈外周血即可完成檢測(cè)，極大降低了受試者的心理負(fù)擔(dān)和身體損傷。