本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥，具體涉及一種基于活細(xì)胞cba法的mog-igg自身抗體檢測(cè)試劑盒。

背景技術(shù)：

1、大量研究證實(shí)，血清mog-igg抗體是mogad（抗髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白免疫球蛋白g抗體相關(guān)疾病）的生物學(xué)標(biāo)志物，具有致病性。目前臨床mog-igg抗體檢測(cè)方法為固定細(xì)胞cba法，其與活細(xì)胞cba法的區(qū)別在于底物細(xì)胞的狀態(tài)。固定細(xì)胞cba法底物細(xì)胞在與臨床樣本孵育前需要先進(jìn)行固定，會(huì)導(dǎo)致抗原的空間構(gòu)象破壞，影響其敏感性和特異性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、鑒于此，本發(fā)明提供了一種基于活細(xì)胞cba法的mog-igg自身抗體檢測(cè)試劑盒，能夠穩(wěn)定表達(dá)mog抗原，并保留mog抗原的完整空間構(gòu)象，提高mog-igg自身抗體檢測(cè)靈敏度。

2、為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供了一種基于活細(xì)胞cba法的mog-igg自身抗體檢測(cè)試劑盒，包括未經(jīng)固定的gfp-mog-hek293活細(xì)胞株細(xì)胞片。

4、優(yōu)選地，還包括pbs緩沖液、熒光二抗。

5、優(yōu)選地，所述gfp-mog-hek293細(xì)胞株的制備方法包括以下步驟：

6、s1、構(gòu)建gfp-mog重組質(zhì)粒；

7、s2、將所述gfp-mog重組質(zhì)粒進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、抽提，獲得gfp-mog慢病毒質(zhì)粒；

8、s3、培養(yǎng)hek293細(xì)胞；

9、s4、將所述gfp-mog慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染hek293細(xì)胞后，培養(yǎng)篩選，獲得gfp-mog-hek293細(xì)胞株。

10、優(yōu)選地，在步驟s1中，構(gòu)建gfp-mog重組質(zhì)粒的具體步驟為：首先在mog目的基因兩端加設(shè)ecori/bamhi酶切位點(diǎn)；在lenti-cmv-mcs-3xflag-pgk-puro載體中插入ecori/bamhi酶切位點(diǎn)；通過(guò)dna?ligation?kit將mog目的基因插入載體中，獲得gfp-mog質(zhì)粒。

11、優(yōu)選地，在步驟s3中，培養(yǎng)hek293細(xì)胞時(shí)，將hek293細(xì)胞接種在含有10ml完全培養(yǎng)基的100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)。

12、優(yōu)選地，完全培養(yǎng)基包括dmem、fbs以及p/s，其中，fbs占總體積的10%，p/s占總體積的1%。

13、優(yōu)選地，在步驟s4中，所述gfp-mog慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染hek293細(xì)胞的步驟為：待hek293細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到60-80%時(shí)，將s2得到的慢病毒加入到培養(yǎng)hek293細(xì)胞的培養(yǎng)皿中，并加入聚凝胺，進(jìn)行細(xì)胞慢病毒轉(zhuǎn)染；和/或，

14、在步驟s4中，轉(zhuǎn)染后，培養(yǎng)篩選的步驟為：感染72h后，加入終濃度為2ug/ml的嘌呤霉素，此后每隔2-3天換一次含2ug/ml嘌呤霉素的新鮮完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)2周。

15、優(yōu)選地，聚凝胺加入的最終濃度為5μg/ml；和/或，

16、轉(zhuǎn)染時(shí)間為12-20h。

17、優(yōu)選地，未經(jīng)固定的gfp-mog-hek293活細(xì)胞株細(xì)胞片的制備方法的步驟為：篩選成功的穩(wěn)定表達(dá)mog的gfp-mog-hek293細(xì)胞株接種在6孔板中，使其貼壁生長(zhǎng)至80-90%。

18、優(yōu)選地，6孔板中鋪有載玻片，細(xì)胞株在載玻片上貼壁生長(zhǎng)。細(xì)胞接種密度為1x106cells/ml，完全培養(yǎng)基包括dmem、fbs以及p/s，其中，fbs占總體積的10%，p/s占總體積的1%。

19、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

20、（1）本發(fā)明的試劑盒中的gfp-mog-hek293細(xì)胞株可穩(wěn)定表達(dá)mog抗原，并保留mog抗原的完整空間構(gòu)象，提高mog-igg自身抗體檢測(cè)靈敏度。

21、（2）本發(fā)明提供的活細(xì)胞cba法檢測(cè)mog-igg技術(shù)，所獲得的gfp-mog-hek293細(xì)胞株可長(zhǎng)期穩(wěn)定培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)血清樣本的即時(shí)檢測(cè)，顯著縮短檢測(cè)時(shí)間。

技術(shù)特征：

1.一種基于活細(xì)胞cba法的mog-igg自身抗體檢測(cè)試劑盒mog-igg自身抗體檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括未經(jīng)固定的gfp-mog-hek293活細(xì)胞株細(xì)胞片。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，還包括pbs緩沖液、熒光二抗。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述gfp-mog-hek293細(xì)胞株的制備方法包括以下步驟：

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，在步驟s1中，構(gòu)建gfp-mog重組質(zhì)粒的具體步驟為：首先在mog目的基因兩端加設(shè)ecori/bamhi酶切位點(diǎn)；在lenti-cmv-mcs-3xflag-pgk-puro載體中插入ecori/bamhi酶切位點(diǎn)；通過(guò)dna?ligation?kit將mog目的基因插入載體中，獲得gfp-mog質(zhì)粒。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，在步驟s3中，培養(yǎng)hek293細(xì)胞時(shí)，將hek293細(xì)胞接種在含有10ml完全培養(yǎng)基的100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，完全培養(yǎng)基包括dmem、fbs以及p/s，其中，fbs占總體積的10%，p/s占總體積的1%。

7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，在步驟s4中，所述gfp-mog慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染hek293細(xì)胞的步驟為：待hek293細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到60-80%時(shí)，將s2得到的慢病毒加入到培養(yǎng)hek293細(xì)胞的培養(yǎng)皿中，并加入聚凝胺，進(jìn)行細(xì)胞慢病毒轉(zhuǎn)染；和/或，

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，聚凝胺加入的最終濃度為5ug/ml；和/或，

9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，未經(jīng)固定的gfp-mog-hek293活細(xì)胞株細(xì)胞片的制備方法的步驟為：篩選成功的穩(wěn)定表達(dá)mog的gfp-mog-hek293細(xì)胞株接種在6孔板中，使其貼壁生長(zhǎng)至80-90%。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于，6孔板中鋪有載玻片，細(xì)胞株在載玻片上貼壁生長(zhǎng)。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種基于活細(xì)胞CBA法的MOG?IgG自身抗體檢測(cè)試劑盒，用于檢測(cè)MOG?IgG抗體的底物細(xì)胞為穩(wěn)定表達(dá)MOG靶抗原的活細(xì)胞株，本發(fā)明的檢測(cè)底物細(xì)胞GFP?MOG?HEK293細(xì)胞株能夠穩(wěn)定表達(dá)MOG抗原，活的底物細(xì)胞在檢測(cè)時(shí)可保留MOG抗原的完整空間構(gòu)象，提高M(jìn)OG?IgG自身抗體檢測(cè)靈敏度。

技術(shù)研發(fā)人員：周勇,孫丹,曹盼
受保護(hù)的技術(shù)使用者：邁諾（武漢）醫(yī)學(xué)生物科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/2