本發(fā)明涉及一種細胞清洗液、漿膜腔液基細胞處理用試劑組合、漿膜腔液基細胞染色試劑盒及染色方法，屬于生物檢測。

背景技術：

1、漿膜腔積液即胸腔、心包腔和腹腔等體腔內聚集的過量液體，是腫瘤和非腫瘤性疾病的常見臨床表現，有時甚至是患者的唯一癥狀。各類良惡性疾病均可引起漿膜腔積液，它是部分惡性腫瘤，特別是惡性間皮瘤及一些淋巴造血系統(tǒng)腫瘤最早出現的臨床表現。對于惡性腫瘤來說，漿膜腔積液除了脫落游離的腫瘤細胞外，還包括免疫細胞、間皮細胞、紅細胞、間充質干細胞，以及大量的蛋白質、氨基酸、脂類、糖、電解質等，這些成分與腫瘤微環(huán)境密切相關，為研究腫瘤發(fā)生發(fā)展提供了重要的臨床取材來源。因此，其性質的判斷有助于惡性腫瘤診斷，并追述其來源、類別等，為臨床診斷及治療提供依據。

2、目前對積液良惡性的鑒別主要采用常規(guī)細胞學檢查，但該方法存在敏感度低，易受病理醫(yī)師主觀因素影響的局限性，因此，積液細胞學評價逐漸成為細胞病理學診斷中最具挑戰(zhàn)性的領域之一。在許多情況下，僅根據細胞形態(tài)學不能做出明確的診斷。一方面，血性胸腹水在細胞學標本制片過程中，由于標本中含有大量紅細胞，特別是某些樣本本身含血細胞較多而癌細胞又較少時，紅細胞會將很少的癌細胞掩蓋，致使細胞學診斷造成漏診；另一方面，由于漿膜腔積液抽取的位置、數量存在一定的局限性，不容易查找出癌細胞，因此在細胞學檢測結果為陰性時，并不能完全排除惡性腫瘤的可能，仍存在漏診的問題。此外，良性間皮細胞在眾多刺激下經歷了無數的結構和細胞改變，而且分化良好或交界性(邊緣性)惡性細胞可偽裝成良性細胞，容易造成細胞形態(tài)學特征重疊情況，致使無法區(qū)分游離惡性細胞(特別是轉移性腺癌和反應性間皮細胞)。因此，有時僅憑細胞形態(tài)學無法對漿液性積液作出明確的細胞學診斷。

3、隨著醫(yī)學科學的進步，單純的細胞形態(tài)學診斷已無法滿足臨床診斷治療的需求，免疫組織化學和分子檢測已經成為必要的輔助手段。在過去的十年中，大量文獻數據表明，在所有可用的方法中，免疫細胞化學(icc)染色在臨床診斷治療中，對積液性質的判斷具有顯著優(yōu)越性和不可替代的重要意義，是一個相對客觀、且最為常用的染色技術。免疫細胞化學已在許多實驗室中被用于積液良惡性的判斷，進而為腫瘤良惡性的判斷提供參照，但檢測時多數采用的是細胞蠟塊。而細胞蠟塊存在制備周期較長、步驟繁瑣、檢查過程相對耗時、腫瘤細胞較少時容易丟失的問題。

4、液基薄層細胞制片法是近些年發(fā)展起來的國際上較為先進的細胞學檢測技術，其是將采集脫落樣品的采集器放置于細胞保存處理液的裝置中，由細胞保存處理液對脫落細胞樣品進行漂洗，再采用手動、半自動或全自動方法將樣品分散、過濾后制片，最后進行纖維檢測和診斷。液基薄層細胞制片法特別適合于漿膜腔積液細胞學分類檢測，因此防止脫落細胞形態(tài)結構發(fā)生變化的脫落細胞保存液，對液基薄層細胞制片及后續(xù)細胞學檢測至關重要。目前大多數的脫落細胞保存液主要起到保持、固定脫落細胞原有形態(tài)結構的作用，但無法去除較多的紅細胞，使得較多的紅細胞對脫落細胞的臨床診斷帶來干擾。

5、因此，臨床上對于漿膜腔積液一般進行前處理以去除紅細胞，病理科采用氯化鉀低滲、冰醋酸或其他一些紅細胞去除劑，但操作繁瑣，使用不夠便利，處理效果也不盡人意。而目前市面上已有的細胞清洗液多為進口品牌，成本較高，且主要是為滿足巴氏形態(tài)學染色，對于免疫細胞染色結果沒有保證，甚至出現假陰性的染色結果，嚴重影響結果判斷。

6、因此，開發(fā)出一種能有效去除紅細胞的細胞清洗液或保存液，對于提高液基薄層細胞制片質量、防止血性漿膜腔積液中過多紅細胞對脫落細胞的臨床診斷帶來干擾有重要意義。

技術實現思路

1、本發(fā)明的第一個目的是提供一種細胞清洗液，為現有技術提供一種能保持檢測細胞形態(tài)完整、抗原性良好的同時，有效去除紅細胞的細胞清洗液。

2、本發(fā)明的第二個目的是提供一種漿膜腔液基細胞處理用試劑組合，為現有技術提供一種能提高后續(xù)染色效果的漿膜腔液基細胞處理用試劑組合。

3、本發(fā)明的第三個目的是提供一種漿膜腔液基細胞染色試劑盒，為現有技術提供一種兼顧形態(tài)學及免疫細胞化學染色效果、靈敏度較高的漿膜腔液基細胞染色試劑盒。

4、本發(fā)明的第四個目的是提供一種漿膜腔液基細胞染色方法，為現有技術提供一種特異性、準確性較高的漿膜腔液基細胞染色方法。

5、為了實現上述目的，本發(fā)明的一種細胞清洗液的技術方案是：

6、一種細胞清洗液，所述細胞清洗液由a組分和b組分組成：所述a組分為體積分數40～50％的乙醇溶液；所述b組分由以下成分組成：福爾馬林10vol％、離子維持劑0.8～0.9wt％、緩沖劑0.095～0.190wt％、水余量；所述b組分的ph為7.20～7.40；使用時a組分、b組分按體積比1:1混合。

7、上述方案的有益效果在于：本發(fā)明提供的一種細胞清洗液為開拓型發(fā)明。為了兼顧形態(tài)學及icc的染色效果，本發(fā)明通過前期大量的實驗發(fā)現，提供了一種細胞清洗液的配方，后續(xù)的實驗證明，該細胞清洗液在對血性標本進行處理時，可以實現快速溶血、去黏液及蛋白液等效果，同時有效固定其他細胞，保證了其他細胞的形態(tài)完整性和良好的抗原性。而且經自然沉降制備得到薄而均勻的細胞層，適用于細胞學檢測，背景清晰，能完整展現出細胞形態(tài)和結構。本發(fā)明的細胞清洗液是一種用于清洗和溶解紅細胞的介質，能夠對紅細胞產生破壞作用，同時又是可以保證其他細胞形態(tài)完整性、良好抗原性的有效試劑。

8、進一步地，本發(fā)明提供的細胞清洗液處理紅細胞速度更快，效果更好，兼顧形態(tài)學及免疫細胞化學染色效果，有利于打破細胞清洗液依賴進口品牌的狀態(tài)，推動國產原研產品的開發(fā)，降低成本。

9、具體地，乙醇是有機溶劑，在富含紅細胞的樣本中加入適量濃度的乙醇后，大量乙醇分子順濃度差進入紅細胞，使紅細胞內滲透壓高于紅細胞外滲透壓，水通道開放，進而使大量水分子進入紅細胞，撐破紅細胞，達到破紅的目的。而實驗發(fā)現，過高濃度的乙醇會使紅細胞的表面蛋白質迅速凝集，并阻止乙醇的滲入，使得破碎紅細胞的效果急劇變差。同時，乙醇也能起到固定劑的作用。甲醛溶液具有滲透力強、固定均勻、細胞收縮小的特點，能有效固定有細胞核的細胞，對破碎后沉淀物(即其他細胞)起固定作用。兩者協同使得樣本中的紅細胞快速溶解、并將有核細胞快速且有效固定，保留細胞的形態(tài)結構，以便更好地進行細胞檢測。緩沖劑可有效緩解細胞釋放自溶副產物所導致的ph變化，維持細胞形態(tài)特征。離子強度維持劑可以調節(jié)溶液的滲透壓，從而維持細胞的原本形態(tài)。

10、具體地，福爾馬林為濃度為37～40％的甲醛溶液。

11、作為進一步地改進，所述緩沖劑包括磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀中的一種或兩種；所述離子維持劑包括氯化鈉、氯化鉀、氯化銨中的一種、兩種或三種。

12、為了實現上述目的，本發(fā)明的一種漿膜腔液基細胞處理用試劑組合的技術方案是：

13、一種漿膜腔液基細胞處理用試劑組合，所述試劑組合包括所述的細胞清洗液和細胞保存液；所述細胞保存液由以下成分組成：乙醇18～22vol％、乙二醇4～8vol％、異丙醇6～12vol％、螯合劑1～2mm/l、滲透壓維持劑1.0～1.2wt％、表面活性劑0.05vol％，溶劑為緩沖液；所述細胞保存液的ph為6.80～7.20。

14、上述方案的有益效果在于：本發(fā)明通過實驗證明，血性細胞樣本經過細胞清洗液的處理之后，紅細胞快速、有效裂解，而其他細胞(如：間皮細胞、淋巴細胞等)結構完整、不變形、核質分明、核仁清晰。將處理后的細胞樣本保存在本發(fā)明提供的細胞保存液中，能有效保存其結構形態(tài)，兩者聯合使用，有助于提高制片質量，提高后續(xù)細胞學分析的準確性和可靠性。

15、作為進一步地改進，所述緩沖液為pbs緩沖液、tris-hcl緩沖液、pipes緩沖液、乙酸緩沖液、醋酸鈉緩沖液、磷酸緩沖液、檸檬酸緩沖液、咪唑緩沖液、三乙醇胺鹽酸鹽緩沖液中的一種。

16、作為進一步地改進，所述螯合劑選自乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二鈉、檸檬酸鈉、肝素、肝激酶、鏈激酶、枸緣酸鈉中的一種或兩種。

17、作為進一步地改進，所述滲透壓維持劑選自氯化鈉、氯化鉀、氯化銨中的一種或兩種；所述表面活性劑選自吐溫-20、曲拉通x-100、乙基苯基聚乙二醇中的一種或兩種。

18、為了實現上述目的，本發(fā)明的一種漿膜腔液基細胞染色試劑盒的技術方案是：

19、一種漿膜腔液基細胞染色試劑盒，所述漿膜腔液基細胞染色試劑盒包括所述的漿膜腔液基細胞處理用試劑組合。

20、上述方案的有益效果在于：本發(fā)明的漿膜腔液基細胞染色試劑盒包括上述的細胞清洗液，在面對血性漿膜腔積液時，能快速有效地溶解紅細胞，完好保存標本的細胞形態(tài)及良好抗原性，提高了制片質量，使制作完成的液基細胞片中細胞分布更均勻，背景更加清晰，細胞結構更易觀察，提高診斷準確性。

21、進一步地，本發(fā)明提供的漿膜腔液基細胞染色試劑盒適配于全自動免疫細胞化學染色機，能實現全自動液基制片，提高工作效率，減少誤差，提高制片質量，減少污染，提高制片安全性。另外，沉降倉圈定細胞區(qū)域，試劑單獨滴加，避免交叉污染，避免試劑流失，提高陽性檢出率，避免假陰性。

22、作為進一步地改進，所述漿膜腔液基細胞染色試劑盒包括過氧化物酶封閉劑、一抗后試劑、多聚物、dab底物、dab緩沖液、蘇木素。

23、上述方案的有益效果在于：本發(fā)明提供的漿膜腔液基細胞染色試劑盒采用了一種基于辣根過氧化物酶標記的微聚合物標記抗體的非生物素二抗檢測系統(tǒng)，采用自主研發(fā)的“microstracker”微聚合物層疊技術，剔除fc片段，特異性更好，微聚合物骨架，更快的滲透速率，靈敏度更高。

24、為了實現上述目的，本發(fā)明的一種漿膜腔液基細胞染色方法的技術方案是：

25、一種漿膜腔液基細胞染色方法，包括以下步驟：

26、(1)將待制片的漿膜腔積液樣本離心，在沉淀物中加入所述的漿膜腔液基細胞處理用試劑組合中的細胞清洗液，震蕩混勻，離心、保留沉淀于所述的漿膜腔液基細胞處理用試劑組合中的細胞保存液中；

27、(2)將步驟(1)保存于細胞保存液中的樣本進行液基制片后，進行后續(xù)染色。

28、上述方案的有益效果在于：本發(fā)明的漿膜腔液基細胞染色方法中，將漿膜腔積液細胞樣本經過細胞清洗液的處理和細胞保存液的保存后進行液基制片，在進行后續(xù)染色過程，有效解決了一些微量細胞學標本，如細針穿刺細胞學標本無法進行石蠟包埋的困惱，為患者提供了快速精準的診斷治療依據。而且經過處理，完好保存標本的細胞形態(tài)及良好抗原性。使制作完成的液基細胞片中細胞分布更均勻，背景更加清晰，細胞結構更易觀察，提高診斷準確性。

29、作為進一步地改進，所述染色包括巴氏染色和/或者免疫細胞化學染色。

30、與現有技術相比，本發(fā)明的有益效果在于：

31、第一，本發(fā)明公開了一種細胞清洗液，通過對漿膜腔積液樣本進行清洗、溶解紅細胞、防止蛋白質沉淀、溶解黏液等預處理，完好保存標本的細胞形態(tài)及良好抗原性。使制作完成的液基細胞片中細胞分布更均勻，背景更加清晰，細胞結構更易觀察，提高診斷準確性。

32、第二，本發(fā)明公開的一種漿膜腔液基細胞檢測試劑盒能搭載全自動免疫細胞化學染色機(如：cnt480)。全自動液基制片，提高工作效率，減少誤差；提高制片質量，減少污染；提高制片安全性。支持連續(xù)上機，三個獨立反應腔，同時加載48張玻片，玻片可連續(xù)更換，于一個批次完成后便可立即執(zhí)行下一批次實驗，并可隨意編輯各種不同的免疫細胞化學染色程序。另外，沉降倉圈定細胞區(qū)域，試劑單獨滴加，避免交叉污染，避免試劑流失，提高陽性檢出率，避免假陰性。具體的優(yōu)勢如下：①即時檢測：液基制片直接進行免疫細胞化學染色，無需細胞蠟塊包埋過程，提升診斷速度；②適用樣本類型廣：適用于微量細胞標本及難以包埋蠟塊樣本；③背景干凈：染色清晰，可有效改善血性漿膜腔積液樣本假陽性效果；④染色結果準確可靠：自然沉降法制片，優(yōu)先捕獲病變細胞，有效富集更多細胞；⑤重復制片：相同樣本可同時制備多張細胞白片進行多指標染色；⑥多功能自由選擇：全自動液基制片+巴氏染色+免疫細胞化學染色；⑦設計靈活：單倉/雙倉，通量翻倍，染色指標自由組合。綜上，本發(fā)明的漿膜腔液基細胞檢測試劑盒可實現制片、染色全流程全自動化，無需人工干預，操作簡單便捷，極大的提高了染色效率和實驗室標準化水平。

33、第三，本發(fā)明的漿膜腔積液細胞樣本經過前處理后，搭載全自動免疫細胞化學染色機既能實現實現巴氏染色，又能實現免疫細胞化學染色，在進行漿膜腔液基細胞檢測時，將細胞形態(tài)學和免疫細胞化學染色的聯合使用，可以大大提高診斷的敏感性、特異性和準確性，為臨床治療提供可靠依據，可作為組織樣本缺乏時伴隨診斷的重要補充。