本發(fā)明涉及一種五倍子水提物特征圖譜和對(duì)照?qǐng)D譜的構(gòu)建方法、不同商品規(guī)格五倍子的區(qū)分方法，屬于中藥分析。

背景技術(shù)：

1、五倍子為漆樹科植物 rhus?chinensismill.、青麩楊 rhus?potaniniimaxim.?或紅麩楊 rhus?punjabensisstew.var.sinica?(diels)rehd.et?wils.葉上的蟲癭，主要由五倍子蚜 melaphis?chinensis?(bell)baker寄生而形成。有斂肺降火，澀腸止瀉，斂汗，止血，收濕斂的功效。用于肺虛久咳，肺熱痰嗽，久瀉久痢，自汗盜汗，消渴，便血痔血，外傷出血，癰腫瘡毒，皮膚濕爛等癥。

2、現(xiàn)代研究表明，五倍子的化學(xué)成分包括鞣質(zhì)（又稱單寧酸、鞣酸）、五倍子酸、五倍子油等，其中以鞣質(zhì)的含量最高，可達(dá)70%。五倍子具有止瀉、抗菌、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗衰老和降血糖等藥理作用，此外還有抗癌、抗生育、清除自由基等作用。

3、五倍子按藥材形態(tài)來判斷其品質(zhì)，依據(jù)形態(tài)差異分為“角倍”和“肚倍”2?種規(guī)格?！吨兴幉纳唐芬?guī)格質(zhì)量鑒別》（1995年）記載:“以個(gè)大、完整、壁厚、色灰褐者為佳”；《中國藥材學(xué)》（1996年）記載：藥材外形分為“角倍”和“肚倍”，“以個(gè)大、完整、壁厚、色灰褐、純凈者為佳”；《中華本草》（1999年）記載：藥材外形分為“角倍”和“肚倍”，“以個(gè)大、完整、壁厚、色灰褐、純凈者為佳”；《現(xiàn)代中藥材商品通鑒》(2001年)記載：按外形分為“角倍”和“肚倍”，肚倍質(zhì)優(yōu)，角倍質(zhì)次;《500味常用中藥材的經(jīng)驗(yàn)鑒別》（2002年)優(yōu)劣評(píng)價(jià)以“以個(gè)大、完整、壁厚、色灰褐者為佳，”；并按外形分“角倍”和“肚倍”2個(gè)規(guī)格，按大小、單個(gè)質(zhì)量分為2個(gè)等級(jí)?！兜赖厮幉膱D典》(西南卷)(2003年)中記述：按外形分為“角倍”和“肚倍”，“以個(gè)大、完整、壁厚、色灰褐、純凈者為佳”。

4、目前對(duì)于不同商品規(guī)格肚倍對(duì)比研究主要集中在性狀和含量方面的研究。梁晴等對(duì)五倍子不同商品規(guī)格的質(zhì)量進(jìn)行研究，質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果顯示肚倍各等級(jí)沒食子酸含量高于角倍，與傳統(tǒng)認(rèn)為的“肚倍質(zhì)優(yōu)，角倍質(zhì)次”相吻合;?壁厚測(cè)量結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肚倍壁厚明顯大于角倍，使肚倍外觀較堅(jiān)實(shí)，而角倍脆弱，所以市場(chǎng)上破碎的樣品大多為角倍，這可能是傳統(tǒng)肚倍優(yōu)于角倍的主要原因。五倍子飲片經(jīng)過煎煮制成標(biāo)準(zhǔn)湯劑，失去了飲片的形狀，無法對(duì)不同商品規(guī)格的五倍子標(biāo)準(zhǔn)湯劑進(jìn)行區(qū)分，因此需要建立專屬性更強(qiáng)的特征圖譜用于區(qū)分。專利（申請(qǐng)?zhí)枺?019108219503，一種五倍子藥材的uplc指紋圖譜的構(gòu)建方法、通過該方法構(gòu)建的指紋圖譜及其應(yīng)用）公開了分別建立了五倍子（肚倍）、五倍子（角倍）藥材特征圖譜，采用相似度對(duì)二者進(jìn)行區(qū)分，未明確二者差異的特征峰，且未對(duì)區(qū)分點(diǎn)進(jìn)行定量，無法用于區(qū)分五倍子（肚倍）和五倍子（角倍）水提物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、發(fā)明目的：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是一種五倍子水提物特征圖譜和對(duì)照?qǐng)D譜的構(gòu)建方法、不同商品規(guī)格五倍子的區(qū)分方法。

2、技術(shù)方案：為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種五倍子（肚倍）特征圖譜的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

3、（1）供試品溶液的制備：取五倍子（肚倍）標(biāo)準(zhǔn)湯劑，加有機(jī)溶劑提取，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液；

4、（2）參照物溶液的制備：取沒食子酸對(duì)照品、1,2,3,4,6- o-五沒食子?；咸烟菍?duì)照品，分別加溶劑溶解，既得對(duì)照品溶液；取五倍子（角倍或肚倍）對(duì)照藥材，加入甲醇，超聲處理，放冷，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為對(duì)照藥材參照物溶液；

5、（3）特征圖譜的建立：取五倍子（肚倍）標(biāo)準(zhǔn)湯劑和對(duì)照品溶液，分別注入高效液相色譜中，測(cè)定，即得特征圖譜；所述特征圖譜具有共有峰10個(gè)，取沒食子酸為對(duì)照品，峰1為沒食子酸的色譜峰，與沒食子酸參照物相應(yīng)的峰為s1峰，計(jì)算峰2~峰4與s1峰的相對(duì)保留時(shí)間，其相對(duì)保留時(shí)間在規(guī)定值的±10%范圍以內(nèi)，峰2~峰4的規(guī)定值分別為2.85、3.18、3.86；取1,2,3,4,6- o-五沒食子?；咸烟菫閷?duì)照品，峰8為1,2,3,4,6- o-五沒食子?；咸烟堑纳V峰；與1,2,3,4,6- o-五沒食子?；咸烟窍鄳?yīng)的峰為s2峰，計(jì)算峰5~峰7、峰9、峰10與s2峰的相對(duì)保留時(shí)間，其相對(duì)保留時(shí)間在規(guī)定值的±10%范圍以內(nèi)，峰5~峰7、峰9、峰10的規(guī)定值分別為0.49、0.73、0.89、1.11、1.24。

6、其中，步驟（3）中所述高效液相色譜的色譜條件為：色譜柱：agilent?aq-c18；進(jìn)樣量為1μl；流速：0.25~0.35ml/min；柱溫：25~35℃；檢測(cè)波長：273或280nm；乙腈為流動(dòng)相a，0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相b進(jìn)行梯度洗脫。

7、其中，步驟（3）中所述梯度洗脫為：0～5min，流動(dòng)相a的體積分?jǐn)?shù)為8%，流動(dòng)相b的體積分?jǐn)?shù)為92%；5～6min，流動(dòng)相a的體積分?jǐn)?shù)為8→14%，流動(dòng)相b的體積分?jǐn)?shù)為92→86%；6～13min，流動(dòng)相a的體積分?jǐn)?shù)為14→16%，流動(dòng)相b的體積分?jǐn)?shù)為86→84%；13~17min，流動(dòng)相a的體積分?jǐn)?shù)為16→17%，流動(dòng)相b的體積分?jǐn)?shù)為84→83%；17~20min，流動(dòng)相a的體積分?jǐn)?shù)為17→19%，流動(dòng)相b的體積分?jǐn)?shù)為83→81%；20~25min，流動(dòng)相a的體積分?jǐn)?shù)為19→23%，流動(dòng)相b的體積分?jǐn)?shù)為81→77%；25~30min，流動(dòng)相a的體積分?jǐn)?shù)為23%，流動(dòng)相b的體積分?jǐn)?shù)為77%。

8、其中，步驟（1）中，取五倍子（肚倍）飲片，加入水浸泡，煎煮，過濾，濾液減壓濃縮，并冷凍干燥，即得五倍子（肚倍）標(biāo)準(zhǔn)湯劑。

9、本發(fā)明還提供一種建立五倍子（肚倍）對(duì)照?qǐng)D譜的方法，包括以下步驟：

10、（1）分別制備多批次五倍子（肚倍）標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液；

11、（2）根據(jù)權(quán)利要求1所述的五倍子（肚倍）特征圖譜的構(gòu)建方法對(duì)所述供試品溶液分別進(jìn)行檢測(cè)，得到五倍子標(biāo)準(zhǔn)湯劑的特征圖譜；

12、（3）將得到的特征圖譜導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)建立五倍子標(biāo)準(zhǔn)湯劑的對(duì)照?qǐng)D譜。

13、本發(fā)明還提供一種區(qū)分五倍子（肚倍）和五倍子（角倍）的方法，包括以下步驟：

14、（1）制備供試品溶液：分別將五倍子標(biāo)準(zhǔn)湯劑，加有機(jī)溶劑提取，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液；

15、（2）制備對(duì)照品溶液：分別稱定對(duì)照品沒食子酸和1,2,3,4,6-o-五沒食子?；咸烟?，加入甲醇溶液作為對(duì)照品參照物溶液；稱定五倍子對(duì)照藥材，加入甲醇提取，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為對(duì)照藥材參照物溶液。

16、（3）高效液相圖譜檢測(cè)：分別取供試溶液或?qū)φ掌啡芤?，注入高效液相色譜儀，進(jìn)行檢測(cè)，記錄色譜圖；取沒食子酸為對(duì)照品，峰1為沒食子酸的色譜峰，與沒食子酸參照物相應(yīng)的峰為s1峰；取1,2,3,4,6- o-五沒食子?；咸烟菫閷?duì)照品，峰8為1,2,3,4,6- o-五沒食子?；咸烟堑纳V峰；與1,2,3,4,6- o-五沒食子?；咸烟窍鄳?yīng)的峰為s2峰；所述高效液相色譜儀的色譜條件為：色譜柱：agilent?aq-c18；進(jìn)樣量為1μl；流速：0.25~0.35ml/min；柱溫：25~35℃；檢測(cè)波長：273或280nm；乙腈為流動(dòng)相a，0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相b進(jìn)行梯度洗脫；所述梯度洗脫為：0～5min，流動(dòng)相a的體積分?jǐn)?shù)為8%，流動(dòng)相b的體積分?jǐn)?shù)為92%；5～6min，流動(dòng)相a的體積分?jǐn)?shù)為8→14%，流動(dòng)相b的體積分?jǐn)?shù)為92→86%；6～13min，流動(dòng)相a的體積分?jǐn)?shù)為14→16%，流動(dòng)相b的體積分?jǐn)?shù)為86→84%；13~17min，流動(dòng)相a的體積分?jǐn)?shù)為16→17%，流動(dòng)相b的體積分?jǐn)?shù)為84→83%；17~20min，流動(dòng)相a的體積分?jǐn)?shù)為17→19%，流動(dòng)相b的體積分?jǐn)?shù)為83→81%；20~25min，流動(dòng)相a的體積分?jǐn)?shù)為19→23%，流動(dòng)相b的體積分?jǐn)?shù)為81→77%；25~30min，流動(dòng)相a的體積分?jǐn)?shù)為23%，流動(dòng)相b的體積分?jǐn)?shù)為77%；

17、（4）分析：在色譜圖中選取相對(duì)保留時(shí)間穩(wěn)定的峰作為特征峰，再與對(duì)照品溶液圖譜的峰進(jìn)行比較；

18、（5）區(qū)分：分別將供試品溶液色譜圖與對(duì)照品溶液色譜圖進(jìn)行比較；當(dāng)供試品溶液色譜圖有峰1~10時(shí)，該供試品為五倍子（肚倍）；當(dāng)供試品溶液色譜圖有峰1、峰2~峰4、峰7、峰8、峰10時(shí)，該供試品為五倍子（角倍）。

19、其中，當(dāng)五倍子標(biāo)準(zhǔn)湯劑存在摻偽情況時(shí)，步驟（5）中還采用以峰7為參照峰的相對(duì)峰面積對(duì)摻偽樣品進(jìn)行區(qū)分，以0.15作為規(guī)定值，最終規(guī)定以沒食子酸為參照峰，峰5與峰6相對(duì)峰面積之和大于0.15，則被檢測(cè)樣品為五倍子（肚倍）；與沒食子酸對(duì)照品參照物峰相對(duì)應(yīng)的峰為s1峰，計(jì)算峰5與峰6的峰面積之和與s1峰的相對(duì)峰面積，相對(duì)峰面積小于0.15，則為角倍。

20、其中，步驟（4）中所述相對(duì)保留時(shí)間是若干組實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值。

21、其中，步驟（4）中所述五倍子（肚倍）特征圖譜具有10個(gè)特征峰，取沒食子酸為對(duì)照品，s1峰為沒食子酸的色譜峰；取1,2,3,4,6-o-五沒食子?；咸烟菫閷?duì)照品，s2峰為1,2,3,4,6-o-五沒食子?；咸烟?；計(jì)算峰5、峰6與s2峰的相對(duì)保留時(shí)間，其相對(duì)保留時(shí)間均應(yīng)在規(guī)定值的±10%范圍之內(nèi)，峰5規(guī)定值為0.49，峰6規(guī)定值為0.73；與沒食子酸參照物峰相對(duì)應(yīng)的峰為s1峰，計(jì)算峰5與峰6的峰面積之和與s1峰的相對(duì)峰面積，相對(duì)峰面積大于0.15。

22、其中，步驟（4）中五倍子（角倍）特征圖譜具有7個(gè)特征峰，取沒食子酸為對(duì)照品，s1峰為沒食子酸的色譜峰；取1,2,3,4,6-o-五沒食子酰基葡萄糖為對(duì)照品，s2峰為1,2,3,4,6-o-五沒食子酰基葡萄糖；計(jì)算峰5、峰6與s2峰的相對(duì)保留時(shí)間，其相對(duì)保留時(shí)間均應(yīng)在規(guī)定值的±10%范圍之內(nèi)，峰5規(guī)定值為0.49、峰6規(guī)定值為0.73；與沒食子酸參照物峰相對(duì)應(yīng)的峰為s1峰，計(jì)算峰5與峰6的峰面積之和與s1峰的相對(duì)峰面積，相對(duì)峰面積小于0.15。

23、有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下顯著優(yōu)點(diǎn)：1、方法簡單，重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確可靠，便于操作，時(shí)間較短，溶劑消耗量少，對(duì)環(huán)境污染??；2、本發(fā)明通過對(duì)不同商品規(guī)格五倍子（肚倍、角倍）成分差別開展的色譜方法，采用超高效液相色譜法，并對(duì)色譜方法進(jìn)行合理控制，以乙腈為流動(dòng)相a，以0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相b進(jìn)行梯度洗脫，建立五倍子（肚倍）10個(gè)共有峰；3、構(gòu)建五倍子（肚倍）標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜，并對(duì)不同商品規(guī)格五倍子（肚倍、角倍）的進(jìn)行對(duì)比研究，對(duì)整個(gè)五倍子標(biāo)準(zhǔn)湯劑內(nèi)在品質(zhì)進(jìn)行把控，能夠比較全面地反應(yīng)不同商品規(guī)格五倍子（肚倍、角倍）標(biāo)準(zhǔn)湯劑的特征，可以為五倍子（肚倍）標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒的內(nèi)在質(zhì)量控制提供新的分析手段，并達(dá)到鑒別不同商品規(guī)格五倍子（肚倍、角倍）的目的。