本發(fā)明屬于食品安全，尤其涉及一種短鏈游離脂肪酸的測定方法及其應用。

背景技術：

1、羊奶或羊奶制品具有很高的營養(yǎng)價值，富含蛋白質、脂肪、維生素及礦物質等多種成分，且總體營養(yǎng)成分優(yōu)于牛奶，更接近人奶，易于被吸收，被稱為“奶中之王”。同時，羊奶或羊奶制品中乳糖含量低，是乳糖不耐受癥患者的較優(yōu)選擇。但羊奶或羊奶制品的銷量遠低于牛奶，這主要與羊奶或羊奶制品的膻味有極大關系，這也是限制羊奶制品開發(fā)利用的主要因素之一。大量研究表明，羊奶或羊奶制品中的膻味與游離脂肪酸的含量有關，其中短鏈游離脂肪酸已酸、辛酸和癸酸是羊奶或羊奶制品膻味的主要成分。因此，這三種短鏈游離脂肪酸的測定對羊奶或羊奶制品膻味的研究和控制至關重要。

2、目前，行業(yè)內對短鏈游離脂肪酸的檢測一般使用氣相色譜(gc)和氣相色譜-串聯質譜法(gc-ms)，但這些測定方法存在明顯的不足，包括：①短鏈游離脂肪酸具有揮發(fā)性，在衍生化和測定過程中易揮發(fā)損失，測定結果穩(wěn)定性和準確度差；②短鏈游離脂肪酸含量較低，且結構中缺少易電離的官能團，導致質譜分析靈敏度不高；③gc以高純度氮氣為載體，對實驗條件要求較高。與gc相比，高效液相色譜(hplc)可在較低溫度下進行，游離脂肪酸熱降解程度和損失程度大大降低，具有較高的靈敏度、準確度和重現性，已逐漸應用于游離脂肪酸的檢測。但短鏈游離脂肪酸不含有發(fā)色基團或熒光基團，無法直接用紫外分光光度計或熒光儀進行痕量水平檢測。

3、因此，開發(fā)一種使用新型、高效的熒光衍生試劑，且能夠提高hplc法測定短鏈游離脂肪酸的靈敏度和準確度的方法，則顯得尤為重要。

技術實現思路

1、鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種短鏈游離脂肪酸的測定方法，該測定方法使用新型、高效的熒光衍生試劑，且能夠提高hplc法測定短鏈游離脂肪酸的靈敏度和準確度。

2、為了達到上述目的，本發(fā)明提供如下技術方案：

3、第一方面，本發(fā)明提供一種短鏈游離脂肪酸的測定方法，所述測定方法包括以下步驟：

4、s1.短鏈游離脂肪酸的提?。?/p>

5、向0.5～1g待測樣品中加入2ml內標(庚酸衍生物)5～30mg、1ml?h2so4溶液(濃度為2.5mol/l)、0.2g?nacl和體積比為2:1的氯仿與甲醇溶液萃取三次(氯仿與甲醇溶液的體積為25ml)，每次靜置1.5h，合并有機相，經無水na2so4干燥后在低溫條件下濃縮，得到提取物；

6、s2.短鏈游離脂肪酸的衍生化反應：

7、在氬氣保護下，將含有1.5ml熒光衍生試劑(0.1～0.8mmol)的二氯甲烷溶液加入到含有6mg提取物的干燥燒瓶中，藍光條件下室溫攪拌2h，反應結束后用于hplc測定；

8、s3.短鏈游離脂肪酸的測定：

9、s3.1.以庚酸衍生物為內標，以己酸、辛酸和癸酸衍生物為標準品，配置混合標準溶液，其中，己酸衍生物與內標的質量比為0.020～10.48，辛酸衍生物與內標的質量比為0.0024～4.76，癸酸衍生物與內標的質量比為0.032～11.33；

10、s3.2.

11、己酸和辛酸hplc測定的方法為等度洗脫：68％甲醇；

12、癸酸hplc測定的方法為梯度洗脫：0～20min，68％甲醇；21～27min，70％甲醇；28～35min，74％甲醇；36～52min，78％甲醇；53～59min，100％甲醇；

13、繪制標準曲線：以各標準品與庚酸衍生物的進樣量比為橫坐標，以各標準品和庚酸衍生物的峰面積比為縱坐標，繪制標準曲線，獲得線性回歸方程；

14、己酸和辛酸標準曲線繪制方法為等度洗脫：68％甲醇；

15、癸酸標準曲線繪制方法為梯度洗脫：0～20min，68％甲醇；21～27min，70％甲醇；28～35min，74％甲醇；36～52min，78％甲醇；53～59min，100％甲醇；

16、s3.3.利用hplc測定待測樣品，得到待分析組分與庚酸衍生物的峰面積比，將峰面積比代入到標準曲線，計算待測樣品中己酸、辛酸和癸酸的含量。

17、s3.3.利用hplc測定待測樣品，得到待分析組分與庚酸衍生物的峰面積比，將峰面積比代入到標準曲線，計算待測樣品中己酸、辛酸和癸酸的含量。

18、式(i)

19、樣品中己酸含量的計算公式如式(i)所示。其中，a為己酸衍生物與內標的峰面積之比；ms為樣品中加入的內標的質量(g)；m為樣品的質量(g)。

20、式(ii)

21、樣品中辛酸含量的計算公式如式(ii)所示。其中，b為辛酸衍生物與內標的峰面積之比；ms為樣品中加入的內標的質量(g)；m為樣品的質量(g)。

22、式(iii)

23、樣品中癸酸含量的計算公式如式(iii)所示。其中，c為癸酸衍生物與內標的峰面積之比；ms為樣品中加入的內標的質量(g)；m為樣品的質量(g)。

24、優(yōu)選的，所述短鏈游離脂肪酸為已酸、辛酸和癸酸。

25、優(yōu)選的，所述熒光衍生試劑為2-重氮基-2-(4-氯苯基)乙酸甲酯。

26、優(yōu)選的，所述步驟s3.2中hplc測定的條件為：流速為1.0ml/min，柱溫為30℃，檢測波長為254nm，進樣量為10μl。

27、優(yōu)選的，所述待測樣品為羊奶、火腿、面粉或油。

28、第二方面，提供一種羊奶或羊奶制品中膻味相關物質的測定方法，包括本發(fā)明所述的測定方法。

29、優(yōu)選的，所述膻味相關物質為短鏈游離脂肪酸，所述短鏈游離脂肪酸為已酸、辛酸和癸酸。

30、第三方面，提供本發(fā)明所述的測定方法在測定已酸中的應用。

31、第四方面，提供本發(fā)明所述的測定方法在測定辛酸中的應用。

32、第五方面，提供本發(fā)明所述的測定方法在測定癸酸中的應用。

33、相對于現有技術，本發(fā)明的有益效果在于：

34、(1)短鏈游離脂肪酸不含有發(fā)色基團或熒光基團，難以直接用于hplc分析。本發(fā)明采用2-重氮基-2-(4-氯苯基)乙酸甲酯作為新型的熒光衍生試劑，大大地提高了檢測的靈敏度；

35、(2)短鏈游離脂肪酸具有一定的揮發(fā)性，衍生反應條件不合適會造成損失，導致檢測結果出現較大的誤差。本發(fā)明采用的熒光衍生試劑可與短鏈游離脂肪酸在常溫常壓下快速、高效反應，提高了短鏈游離脂肪酸的柱前衍生化效率；且降低了揮發(fā)損失，提高了最終檢測結果的準確度。且反應中不需要加入任何催化劑，反應體系簡單，非常適合短鏈游離脂肪酸的常規(guī)檢測；

36、(3)本發(fā)明采用內標標準曲線法，排除了游離脂肪酸提取、衍生和測試過程中外界因素如人員操作、溫度、儀器等帶來的影響，使測定結果更加精確和準確；

37、(4)本發(fā)明在hplc分析中采取梯度洗脫，可實現復雜樣本中癸酸的檢測；

38、(5)本發(fā)明考察了方法的線性、檢出限、定量限、專屬性試驗(空白)、精密度、穩(wěn)定性、準確度(回收率)，證明該含量測定方法科學有效，能夠對復雜樣品中的己酸、辛酸和癸酸進行定量分析；

39、(6)本發(fā)明采用柱前衍生與hplc結合，通過內標標準曲線法可實現對短鏈游離脂肪酸的精準定量，定量限可達1.13～3.50μg/ml，檢測限可達0.53～1.75μg/ml。