本發(fā)明涉及分析檢測，特別涉及用于檢測nadh的生物傳感器、試劑盒及其制備方法和應(yīng)用及nadh的檢測方法。

背景技術(shù)：

1、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nadh)及其氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+)是活細(xì)胞中廣泛存在的重要生物分子。作為一對(duì)酶輔因子，nadh/nad+在300多種復(fù)雜的酶促反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。nadh與其氧化形式nad+的比率是反映許多生理或病理過程整體氧化還原狀態(tài)的關(guān)鍵指標(biāo)，包括能量代謝、線粒體功能、鈣穩(wěn)態(tài)、基因表達(dá)、細(xì)胞死亡、胚胎發(fā)育、血流、衰老、癌癥和糖尿病。此外，nadh已廣泛用于檢測診斷疾病中的酶活性，包括腫瘤形成和缺血。一些專家認(rèn)為，nadh對(duì)基于脫氫酶的生物傳感器和生物燃料電池研究有益，可用于治療帕金森病和抑郁癥。nadh/nad+氧化還原狀態(tài)的檢測對(duì)于確定細(xì)胞代謝狀態(tài)至關(guān)重要。因此，高精度nadh檢測方法的開發(fā)引起了廣泛關(guān)注。

2、目前，實(shí)驗(yàn)室常規(guī)的nadh檢測方法包括化學(xué)發(fā)光法、光電化學(xué)法、電化學(xué)檢測法和高效液相色譜法。所述方法雖然能夠滿足nadh檢測的需要，但實(shí)際應(yīng)用往往受到操作儀器復(fù)雜、操作步驟專業(yè)化等限制，不能進(jìn)行原位檢測。同時(shí)，基于不同功能化金納米粒子、金屬配合物等的nadh快速比色分析工具，具有操作簡單、實(shí)用、高效的優(yōu)點(diǎn)，在實(shí)際nadh檢測中展現(xiàn)出良好的前景。然而，這些方法往往需要高成本的傳感材料，例如基于金的納米材料?；谏鲜鰴z測方法的缺陷，開發(fā)一種靈敏、低成本、低毒性的nadh檢測技術(shù)具有重要的實(shí)際意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、基于上述本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題，本發(fā)明基于螺內(nèi)酯開環(huán)機(jī)理，探針a與nadh的特異性相互作用導(dǎo)致探針a在一定波長范圍內(nèi)的紫外吸光度值顯著降低，且其紫外吸收峰面積與ucnps的發(fā)射峰面積有較大的重疊，從而導(dǎo)致ucnps與探針a之間發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fret)，提出用于檢測nadh的生物傳感器、試劑盒及其制備方法和應(yīng)用及nadh的檢測方法。

2、本發(fā)明的目的之一，是提供用于檢測nadh的生物傳感器，所述生物傳感器包括探針a和上轉(zhuǎn)換納米材料ucnps；進(jìn)一步地，所述探針a的制備包括通過9-(2-羧基苯基)-6-(二乙氨基)-1,2,3,4-四羥基銨高氯酸鹽與喹啉-3-甲醛，制備得到近紅外羅丹明染料；將所述近紅外羅丹明染料和喹啉-3-甲醛加入到ch3cooh中，得到混合物，經(jīng)二氯甲烷萃取，水和鹽洗滌，得到化合物；將所述化合物和meotf加入二氯甲烷、萃取，收集有機(jī)層、干燥并過濾，得到所述探針a；所述探針a為熒光淬滅劑；進(jìn)一步地，所述上轉(zhuǎn)換納米材料ucnps的制備包括ucnps的合成和ucnps的表面修飾；所述上轉(zhuǎn)換納米材料ucnps為納米顆粒；所述上轉(zhuǎn)換納米材料粒徑為25nm～30nm。

3、進(jìn)一步地，所述ucnps為熒光探針組件；進(jìn)一步地，所述ucnps為nadh敏感的熒光比率探針；進(jìn)一步地，所述ucnps表面修飾一層介孔二氧化硅，負(fù)載nadh特異的識(shí)別分子所述探針a，外層修飾表面配體；所述表面配體為β-環(huán)糊精。

4、進(jìn)一步地，所述ucnps的合成包括溶劑熱法合成nayf4:yb,er,tm?ucnps，方法包括：

5、s31、將recl3·6h2o、oa、1-ode混合分散，得到固體全部溶解的化合物；

6、s32、將所述化合物攪拌、抽真空，得到除去氧氣的化合物；

7、s33、去除所述化合物中的結(jié)合水分子，得到橘黃色油狀溶液；

8、s34、加入nh4f和含有naoh的甲醇溶液，調(diào)節(jié)溫度、攪拌，得到含有甲醇溶液；

9、s35、除去所述含有甲醇溶液中的甲醇，得到除去甲醇溶液；

10、s36、將除去甲醇溶液升溫并持續(xù)；

11、s37、加入乙醇進(jìn)行沉淀，離心得到沉淀，用環(huán)己烷清洗、真空干燥，得到表面oa包覆的ucnps固體oa-ucnps。

12、進(jìn)一步地，所述ucnps的表面修飾包括在oa-ucnps表面形成介孔二氧化硅殼層，該方法包括：

13、s41、取十六烷基三甲基溴化銨、溶解，加入氯仿、攪拌，至溶液澄清，得到反應(yīng)液；

14、s42、將所述反應(yīng)液加入水、乙醇和naoh，攪拌，加入teos，攪拌，加入aptes，得到產(chǎn)物；

15、s43、將所述產(chǎn)物離心、乙醇洗滌，轉(zhuǎn)移至含有硝酸銨的乙醇中，攪拌，得到納米熒光探針的乙醇分散液；

16、s44、將單取代β-cd對(duì)甲苯磺酸酯置于所述納米熒光探針的乙醇分散液，氮?dú)夥諊鷶嚢?、反?yīng)，得到ucnps@msio2@β-cd。

17、本發(fā)明的目的之二，是提供用于檢測nadh的試劑盒；進(jìn)一步地，所述試劑盒包括生物傳感器和nadh標(biāo)準(zhǔn)品。

18、進(jìn)一步地，所述nadh標(biāo)準(zhǔn)品系列濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液；進(jìn)一步地，所述標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為0-100nm；優(yōu)選地，所述標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0、10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm和100nm。

19、本發(fā)明的目的之三，是提供所述的生物傳感器或試劑盒的制備方法，包括：

20、s71、所述探針a的制備；

21、s72、所述上轉(zhuǎn)換納米材料ucnps的制備及與所述探針a的結(jié)合；

22、s73、進(jìn)行分裝、包裝，和/或，保存。

23、本發(fā)明的目的之四，是提供所述的生物傳感器或試劑盒在細(xì)胞中nadh的檢測的應(yīng)用；優(yōu)選地，所述細(xì)胞包括pc12細(xì)胞或ρ0細(xì)胞。

24、本發(fā)明的目的之五，是提供nadh的檢測方法，所述檢測方法采用所述的生物傳感器或試劑盒，該檢測方法包括：

25、s91、建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；

26、s92、檢測待測樣品；

27、s93、根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測樣品中nadh的濃度。

28、進(jìn)一步地，所述檢測方法包括熒光探針元件，所述熒光探針元件為具有核殼結(jié)構(gòu)的上轉(zhuǎn)換納米粒子ucnps；

29、所述檢測方法通過計(jì)算發(fā)射峰與參考發(fā)射峰的比值測定nadh含量。

30、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提出了用于檢測nadh的生物傳感器、試劑盒及其制備方法和應(yīng)用及nadh的檢測方法，具備以下有益效果：

31、1.本發(fā)明提供一種高效、靈敏、特異性強(qiáng)的上轉(zhuǎn)換熒光比率探針以檢測細(xì)胞中微量的nadh。與一些類似的nadh傳感器相比，本發(fā)明設(shè)計(jì)的熒光比率探針具有出色的靈敏度(lod＝0.053nm)以及高選擇性，可有效減少生物系統(tǒng)中大多潛在干擾的影響。

32、2.本發(fā)明采用具有核殼結(jié)構(gòu)的ucnps作為熒光探針組件，研制出了一種nadh敏感的熒光比率探針。在其表面修飾一層介孔二氧化硅，負(fù)載nadh特異的識(shí)別分子(探針a)，最外層修飾β-環(huán)糊精作為表面配體，增強(qiáng)生物相容性。

33、3.本發(fā)明制備得到的熒光比率探針已成功應(yīng)用于監(jiān)測活細(xì)胞線粒體內(nèi)nadh水平的波動(dòng)。

技術(shù)特征：

1.用于檢測nadh的生物傳感器，其特征在于，所述生物傳感器包括探針a和上轉(zhuǎn)換納米材料ucnps；

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測nadh的生物傳感器，其特征在于，所述ucnps為熒光探針組件；

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測nadh的生物傳感器，其特征在于，所述ucnps的合成包括溶劑熱法合成nayf4:yb,er,tm?ucnps，方法包括：

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測nadh的生物傳感器，其特征在于，所述ucnps的表面修飾包括在oa-ucnps表面形成介孔二氧化硅殼層，方法包括：

5.用于檢測nadh的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒由權(quán)利要求1～4中任意一項(xiàng)所述用于檢測nadh的生物傳感器制備得到；

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于檢測nadh的試劑盒，其特征在于，所述nadh標(biāo)準(zhǔn)品為系列濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液；

7.根據(jù)權(quán)利要求1～4中任意一項(xiàng)所述的生物傳感器或權(quán)利要求6中所述的試劑盒的制備方法包括：

8.根據(jù)權(quán)利要求1～4中任意一項(xiàng)所述的生物傳感器或權(quán)利要求6中所述的試劑盒在細(xì)胞中nadh檢測的應(yīng)用；

9.nadh的檢測方法，其特征在于，所述檢測方法采用根據(jù)權(quán)利要求1～4中任意一項(xiàng)所述的生物傳感器或權(quán)利要求6中所述的試劑盒，檢測方法包括：

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測方法，其特征在于，所述檢測方法包括熒光探針元件，所述熒光探針元件為具有核殼結(jié)構(gòu)的上轉(zhuǎn)換納米粒子ucnps；

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了用于檢測NADH的生物傳感器、試劑盒及其制備方法和應(yīng)用及NADH的檢測方法，屬于分析檢測技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提出用于檢測NADH的生物傳感器，由上轉(zhuǎn)換納米材料和探針A組成；提出用于檢測NADH的試劑盒，由所述生物傳感器和NADH標(biāo)準(zhǔn)品組成；并提出所述生物傳感器和試劑盒的制備方法及應(yīng)用；提出NADH的檢測方法，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測樣品中NADH的濃度；還包括上轉(zhuǎn)換納米材料表面修飾介孔二氧化硅、介孔二氧化硅負(fù)載探針A、介孔二氧化硅表面修飾β?環(huán)糊精增強(qiáng)生物相容性、探針A淬滅UCNPs的熒光。本發(fā)明提供了一種高效、靈敏、特異性強(qiáng)的上轉(zhuǎn)換熒光比率探針以檢測細(xì)胞中微量的NADH。

技術(shù)研發(fā)人員：秦英凱,王天輝,辛浩林,魏子林,王坤,魏愛麗,李彬,徐龍飛
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中國人民解放軍軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/9