本發(fā)明涉及一種基于三足dna納米機(jī)器的自驅(qū)動和自催化檢測mir-21的方法。

背景技術(shù)：

1、微小核糖核酸(mirna)是一類含有21至23個核苷酸的小型非編碼rna，參與基因表達(dá)的調(diào)控。大多數(shù)研究表明，癌癥患者的mirna水平發(fā)生了變化，表明其在致癌過程中的重要作用。基于這一證據(jù)，mirna已被視為癌癥早期檢測的敏感和特異性生物標(biāo)志物。肺炎支原體肺炎(mpp)病人血清中mirna-21(mir-21)水平變化及與炎癥因子、t淋巴細(xì)胞亞群有明顯關(guān)系。血清中微小核糖核酸mir-21表達(dá)水平對重癥肺炎患者診斷具有重要的參考價(jià)值。目前，常見的mirna檢測方法rt-qpcr、northernblot和微陣列被廣泛用于檢測mirna。靈敏度的提高有利于檢測mirna信號。然而，一些明顯的缺點(diǎn)阻礙了它們的使用，例如處理時(shí)間長、操作過程繁瑣和假陽性結(jié)果高。因此，簡化mirna檢測過程并縮短檢測時(shí)間的新策略值得探索。

2、dna納米機(jī)器是各種以dna結(jié)構(gòu)為基本成分的納米級設(shè)備和納米結(jié)構(gòu)，在藥物輸送和生物傳感分析中顯示出潛在的性能。由于其良好的生物相容性、可預(yù)測的二次結(jié)構(gòu)以及良好的熱穩(wěn)定性和功能改性，它引起了越來越多的關(guān)注。它們通常堿基配對的自由能驅(qū)動。到目前為止，已經(jīng)開發(fā)了各種dna納米機(jī)器，包括dna鑷子、dna助行器、dna電機(jī)、dna齒輪和dna納米籠，用于生物傳感器設(shè)計(jì)、藥物輸送和邏輯分子計(jì)算。盡管取得了顯著進(jìn)展，但由于反應(yīng)速率有限，許多現(xiàn)有方法仍面臨挑戰(zhàn)。這些反應(yīng)速率通常會隨著反應(yīng)時(shí)間的延長而達(dá)到飽和，這主要是因?yàn)榇嬖诳蓴U(kuò)散的反應(yīng)物或燃料分子。此外，受內(nèi)化效率和生物相容性限制的低細(xì)胞內(nèi)dna濃度可能會降低活細(xì)胞中的反應(yīng)動力學(xué)。因此，非常需要開發(fā)一種用于具有自驅(qū)動和自催化作用高效和高靈敏度的dna納米機(jī)器。

3、為解決現(xiàn)有技術(shù)中的問題，本發(fā)明提出一種基于三足dna納米機(jī)器，用于mir-21檢測的自驅(qū)動和自催化檢測的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決現(xiàn)有技術(shù)中的問題，本發(fā)明提出了一種基于三足dna納米機(jī)器的自驅(qū)動和自催化反應(yīng)快速靈敏檢測mir-21的新方法。待測樣品中如果有mir-21，mir-21可以打開dna納米機(jī)器的臂1端。由于鄰近效應(yīng)，釋放的鏈與相鄰臂2結(jié)合形成dna酶結(jié)構(gòu)。切割反應(yīng)后，暴露的dna臂2區(qū)域與附近的臂3雜交，導(dǎo)致標(biāo)記有淬滅基團(tuán)的dna片段(序列q)的離開，從而恢復(fù)熒光強(qiáng)度。然后，具有催化劑作用的dna片段(序列q)與另一個dn?a納米機(jī)器結(jié)合，以啟動下一個自驅(qū)動和自催化循環(huán)。熒光強(qiáng)度與靶濃度之間存在動態(tài)相關(guān)性。因此，可通過熒光強(qiáng)度來定量檢測mir-21的濃度。

2、具體來講，本發(fā)明提供了一種基于三足dna納米機(jī)器的自驅(qū)動和自催化檢測mir-21的方法。包括如下步驟：

3、1)將序列h1、h2和h3以相同的摩爾比溶解在tris-hcl緩沖液中形成三足dna框架，然后，再將序列q加入三足dna框架溶液中形成整個dna納米機(jī)器結(jié)構(gòu)。其中h1序列為5’-tcaacatcagtctgataagctaatcgttttgcggcactttgaccgcataagcta-fam-3’，h2序列為5’-atcgatcgatcgtgatgctgatcgaatraggatgcgtttttcataa?aacagtgccgcttttttttttttttttacgcatcagcgattaaccaggttacacccatgt?ttcgattagcttatc-3’，h3序列為5’-tcgatcagcatcagtctggcggtcaagttttat?gtttttttttttttttttttttagcttatcagaccgatcgatcgat-3’，q序列為5’-bhq1-tagcttatcagactgatgctga-3’，

4、2)將dna納米機(jī)器和mir-21在tris-hcl緩沖溶液混合，mir-21序列為5’-uagcuuaucagacugauguuga-3’。

5、3)檢測步驟2)所得溶液的熒光光譜，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法得出待測樣品中mir-21濃度。

6、優(yōu)選的，步驟1)具體為：將等摩爾量的序列h1、h2和h3溶解在tris-hcl緩沖溶液(10mm?tris-hcl，10mm?mgcl2，ph?7.4)中，然后在37℃下孵育60分鐘，形成三足dna框架。然后，將序列q加入上述溶液中以形成整個dna納米機(jī)器結(jié)構(gòu)。

7、優(yōu)選的，步驟2)具體為：總共250μl的tris-hcl緩沖液(10mm?tris-hcl(ph?7.5)、10mm?nacl和10mm?mgcl2)用于混合150nm的dna納米機(jī)器和mir-21。然后，混合溶液在37℃下反應(yīng)35分鐘。

技術(shù)特征：

1.一種基于三足dna納米機(jī)器的自驅(qū)動和自催化檢測mir-21的方法。包括如下步驟：

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟1)具體為：將等摩爾量的序列h1、h2和h3溶解在tris-hcl緩沖溶液(10mm?tris-hcl，10mm?mgcl2，ph?7.4)中，然后在37℃下孵育60分鐘，形成三足dna框架。然后，將序列q加入上述溶液中以形成整個dna納米機(jī)器結(jié)構(gòu)。

3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟2)具體為：總共250μl的tris-hcl緩沖液(10mm?tris-hcl(ph?7.5)、10mm?nacl和10mm?mgcl2)用于混合150nm的dna納米機(jī)器和待測樣品。然后，混合溶液在37℃下反應(yīng)35分鐘。

4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于步驟3)具體為：熒光光譜在480nm激發(fā)，發(fā)射光譜在505-600nm掃描。用標(biāo)準(zhǔn)曲線法得出待測樣品中mir-21濃度。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明基于三足DNA納米機(jī)器，開發(fā)了一種用于micoRNA?21(miR?21)檢測的自驅(qū)動和自催化的方法。待測樣品中如果有miR?21，miR?21可以通過鄰近效應(yīng)打開三足DNA納米機(jī)器的臂1，與附近的臂2形成DNA酶結(jié)構(gòu)。DNA酶會對臂2上底物鏈切割，剪切后暴露的DNA臂2區(qū)域游離起來與臂3競爭，產(chǎn)生標(biāo)記有淬滅基團(tuán)的DNA片段(序列Q)離開DNA納米機(jī)器，從而恢復(fù)熒光信號。同時(shí)，釋放的序列Q能催化三足DNA納米機(jī)器的下一個自驅(qū)動和自催化循環(huán)反應(yīng)。這種具有緊密空間定位的組分構(gòu)建在單個DNA納米結(jié)構(gòu)上，這顯著提高了局部反應(yīng)物濃度和反應(yīng)速率。熒光信號和miR?21在濃度從10pM到50nM之間具有線性關(guān)系。與自由擴(kuò)散反應(yīng)物相比，反應(yīng)物的有效濃度大大增加。因此，孵育時(shí)間顯著縮短至35分鐘。該策略在miRNA檢測和為疾病診斷提供參考價(jià)值方面具有重要意義。

技術(shù)研發(fā)人員：杜小燕,熱衣汗古麗·卡地爾,馮疆濤,李虎,蘭鴻珠
受保護(hù)的技術(shù)使用者：新疆維吾爾自治區(qū)阿克蘇地區(qū)疾病預(yù)防控制中心
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6