本發(fā)明涉及化學(xué)檢測，尤其是涉及一種介孔二氧化硅殼的納米酶標(biāo)簽及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、甲型流感的反復(fù)流行構(gòu)成了重大的公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)，特別是影響到免疫反應(yīng)受損的弱勢群體，如老年人和兒童。因此，強(qiáng)調(diào)及時準(zhǔn)確的病毒診斷對于有效管理和控制至關(guān)重要。多年來，病毒感染的診斷方式經(jīng)歷了巨大的進(jìn)展，包括傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附試驗（elisa）、免疫熒光試驗（ifa）和聚合酶鏈反應(yīng)（pcr）。在這些方法中，實時逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（rt-pcr）被普遍認(rèn)為是鑒定流感病毒的最終基準(zhǔn)。但是，rt-pcr的使用通常需要專業(yè)的技術(shù)和復(fù)雜的實驗室儀器，限制其在快速現(xiàn)場診斷大規(guī)模應(yīng)用，因此，人們對于開發(fā)和實施即時檢驗越來越感興趣。

2、側(cè)流免疫分析（lfia）是即時檢驗（poct）最常用的平臺，因為它在可負(fù)擔(dān)性、實時分析、移動性和用戶友好的操作等方面具有顯著優(yōu)勢。特別是，比色lfia（c-lfia）由于其易于視覺識別和適合資源受限的環(huán)境而引起了相當(dāng)大的興趣。然而，傳統(tǒng)的基于金納米顆粒（aunp）的比色lfia在其靈敏度方面存在限制。近年來，創(chuàng)新檢測方法的出現(xiàn)提高了lfia的靈敏度，包括熒光技術(shù)、光熱技術(shù)和表面增強(qiáng)拉曼散射（sers）技術(shù)等。然而，這些檢測往往需要特定的儀器，使它們無法在資源有限的環(huán)境中應(yīng)用。

3、納米酶將納米材料的穩(wěn)定性與天然酶的催化活性結(jié)合起來，通過與特定酶底物的催化反應(yīng)，用于比色擴(kuò)增lfia（ca-lfia）。如今，常見的納米酶類型包括貴金屬（au、pt和cu）、金屬氧化物（fe3o4、mno2和tio2）和碳材料（如碳納米管和石墨烯）。在這些納米材料中，利用基于fe3o4復(fù)合納米酶的磁性分離過程可以更有效地回收目標(biāo)分析物。

4、有鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種介孔二氧化硅殼的納米酶標(biāo)簽及其制備方法和應(yīng)用。所述介孔二氧化硅殼的納米酶標(biāo)簽進(jìn)一步提高生物傳感器的性能，制備了介孔結(jié)構(gòu)來增加復(fù)合納米酶的比表面積。

2、為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：

3、第一方面，本發(fā)明提供一種介孔二氧化硅殼的納米酶標(biāo)簽，所述介孔二氧化硅殼的納米酶標(biāo)簽包括fe3o4內(nèi)核以及包覆于所述fe3o4內(nèi)核表面的介孔二氧化硅殼；

4、其中，所述介孔二氧化硅殼的空隙中填充有pt顆粒，且pt顆粒上通過羧基鏈烷硫化物連接有甲型流感n蛋白檢測抗體。

5、優(yōu)選地，所述fe3o4內(nèi)核的粒徑為95~105?nm。

6、優(yōu)選地，所述介孔二氧化硅殼的厚度為15~25?nm。

7、優(yōu)選地，所述介孔二氧化硅殼的比表面積為60~62?m2·g-1。

8、優(yōu)選地，所述介孔二氧化硅殼的平均介孔尺寸為4.8~4.9?nm。

9、優(yōu)選地，所述介孔二氧化硅殼的總孔隙體積為0.12~0.14?cm3·g-1。

10、優(yōu)選地，所述pt顆粒的粒徑為3~6?nm。

11、優(yōu)選地，所述羧基鏈烷硫化物為11-巰基十一烷酸（mua）。

12、第二方面，本發(fā)明提供一種如第一方面所述的介孔二氧化硅殼的納米酶標(biāo)簽的制備方法，所述制備方法包括：

13、（1）將fe3o4納米顆粒分散于含有分散劑的乙醇水溶液中，進(jìn)行第一次超聲處理，加入催化劑，進(jìn)行第二次超聲處理，加入有機(jī)硅脂溶液，進(jìn)行第三次超聲處理，再所述fe3o4納米顆粒的表面包覆二氧化硅殼，得到fe3o4@sio2；

14、（2）將所述fe3o4@sio2重懸于含有分散劑的水溶液中，加入堿后攪拌，對二氧化硅殼進(jìn)行刻蝕，形成介孔二氧化硅殼，通過磁分離法收集產(chǎn)物，得到fe3o4@msio2；

15、（3）將所述fe3o4@msio2、分散劑和氯鉑酸在乙醇水溶液中混合，進(jìn)行第一次攪拌，加入還原劑，進(jìn)行第二次攪拌，使pt顆粒沉積于所述介孔二氧化硅殼的空隙中，得到fe3o4@msio2@pt納米酶；

16、（4）將所述fe3o4@msio2@pt納米酶和羧基鏈烷硫化物在乙醇中混合，進(jìn)行超聲處理，使pt顆粒上連接所述羧基鏈烷硫化物，得到fe3o4@msio2@pt-mua種子；

17、（5）將所述fe3o4@msio2@pt-mua種子分散于mest緩沖液中，進(jìn)行第一次超聲處理，加入 n-羥基琥珀酰亞胺溶液和碳二亞胺溶液，進(jìn)行第二次超聲處理，得到混合物；將所述混合物分散于pbs緩沖液中，加入甲型流感n蛋白檢測抗體，進(jìn)行孵育，同時加入牛血清白蛋白溶液阻斷非結(jié)合部位，通過磁鐵收集產(chǎn)物，得到所述介孔二氧化硅殼的納米酶標(biāo)簽。

18、優(yōu)選地，步驟（1）中，所述分散劑為聚乙烯吡咯烷酮k40；所述催化劑為nh4oh；所述有機(jī)硅脂為四乙氧基硅烷。

19、優(yōu)選地，步驟（1）中，所述fe3o4納米顆粒、乙醇和水的體積比為(0.4~0.8):(30~50):(3~7)；其中，所述fe3o4納米顆粒和分散劑的體積質(zhì)量比為(0.4~0.8)?ml:(10~30)?mg。

20、優(yōu)選地，步驟（1）中，所述fe3o4納米顆粒、催化劑和有機(jī)硅脂溶液的體積比為(1.7~3.7):(3.4~6.4):1；其中，所述有機(jī)硅脂溶液的濃度為0.9~1.0?g·ml-1。

21、優(yōu)選地，步驟（1）中，所述第一次超聲處理、第二次超聲處理和第三次超聲處理的功率各自獨立地為60~100?w。

22、優(yōu)選地，步驟（1）中，所述第一次超聲處理的時間為1~10?min；所述第二次超聲處理的時間為20~40?min；所述第三次超聲處理的時間為20~40?min。

23、優(yōu)選地，步驟（1）中，還包括如下后處理：采用乙醇洗滌所述fe3o4@sio2后，將其重懸于乙醇中；其中，所述fe3o4@sio2的濃度為5~10?μm。

24、優(yōu)選地，步驟（2）中，所述分散劑為聚乙烯吡咯烷酮k15；堿為氫氧化鈉溶液。

25、優(yōu)選地，所述氫氧化鈉溶液的濃度為0.25~0.35?g/ml。

26、優(yōu)選地，步驟（2）中，所述fe3o4@sio2、分散劑和堿的質(zhì)量比為1:(40~60):(300~500)；所述fe3o4@sio2和水的體積比為1:(1~5)。

27、優(yōu)選地，步驟（2）中，所述攪拌的轉(zhuǎn)速為500~550?rpm，所述攪拌的時間為4~8?h。

28、優(yōu)選地，步驟（2）中，還包括如下后處理：采用水和乙醇洗滌所述fe3o4@msio2。

29、優(yōu)選地，步驟（3）中，所述分散劑為聚乙烯吡咯烷酮k40；還原劑為硼氫化鈉。

30、優(yōu)選地，步驟（3）中，所述fe3o4@msio2、還原劑和氯鉑酸的體積比為100:(7~9):(4~6)。

31、優(yōu)選地，步驟（3）中，所述fe3o4@msio2和乙醇水溶液的質(zhì)量體積比為(2~4)?mg:(40~60)?ml；其中，所述乙醇和水的體積比為(10~30):(20~40)。

32、優(yōu)選地，步驟（3）中，所述第一次攪拌、第二次攪拌的轉(zhuǎn)速各自為500~550?rpm。

33、優(yōu)選地，步驟（3）中，所述第一次攪拌的時間為10~20?min；所述第二次攪拌的時間為10~30?min。

34、優(yōu)選地，步驟（3）中，還包括如下后處理：采用乙醇洗滌所述fe3o4@msio2@pt納米酶后，將其重懸于乙醇中；其中，所述fe3o4@msio2@pt納米酶和乙醇的體積比為1:(1~5)。

35、優(yōu)選地，步驟（4）中，所述羧基鏈烷硫化物為11-巰基十一烷酸。

36、優(yōu)選地，步驟（4）中，所述fe3o4@msio2@pt納米酶和羧基鏈烷硫化物的體積比為(100~300):1。

37、優(yōu)選地，步驟（4）中，所述羧基鏈烷硫化物的終濃度為8~12?mm。

38、優(yōu)選地，步驟（4）中，所述超聲處理的功率為60~100?w，所述超聲處理的時間為0.5~2?h。

39、優(yōu)選地，步驟（5）中，所述fe3o4@msio2@pt-mua種子、 n-羥基琥珀酰亞胺溶液和碳二亞胺溶液的體積比為(150~250):1:(4~6)。

40、優(yōu)選地，所述 n-羥基琥珀酰亞胺溶液的濃度為90~110?mm。

41、優(yōu)選地，所述碳二亞胺溶液的濃度為9~11?mm。

42、優(yōu)選地，步驟（5）中，所述混合物、甲型流感n蛋白檢測抗體和牛血清白蛋白的體積比為(330~334):1:(90~120)。

43、優(yōu)選地，步驟（5）中，所述第一次超聲處理和第二次超聲處理的功率各自獨立地為60~100?w。

44、優(yōu)選地，步驟（5）中，所述第一次超聲處理的時間為20~40?s；所述第二次超聲處理的時間為10~20?min。

45、優(yōu)選地，步驟（5）中，所述孵育的時間為140~160?min。

46、優(yōu)選地，步驟（5）中，還包括如下后處理：將磁鐵收集產(chǎn)物重懸于pbst溶液中。

47、第三方面，本發(fā)明提供一種如第一方面所述的介孔二氧化硅殼的納米酶標(biāo)簽在制備用于檢測甲型流感病毒的生物傳感器中的應(yīng)用。

48、相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下有益效果：

49、（1）本發(fā)明建立了一種橫向流免疫分析法（lfia），用于檢測甲型流感（flu?a），使用“三合一”多功能介孔二氧化硅殼的納米酶標(biāo)簽；該納米酶標(biāo)簽用fe3o4作為內(nèi)核，被介孔二氧化硅包裹形成fe3o4@msio2，以及填充在所述介孔二氧化硅殼的空隙中的pt顆粒，該復(fù)合納米酶的優(yōu)點如下：(a)以fe3o4作為內(nèi)核磁芯，使納米酶具有快速的磁分離能力，顯著簡化了制備以及操作過程；(b)介孔二氧化硅的厚度可控，具有良好的穩(wěn)定性和較大的比表面積；（c）通過大比表面積的介孔結(jié)構(gòu)增加pt顆粒的負(fù)載量，提高類pod活性，以顯著提高類pod樣活性，從而提高了檢測靈敏度。

50、（2）本發(fā)明首次通過特異性抗體偶聯(lián)介孔二氧化硅殼納米酶標(biāo)簽，其可用于構(gòu)建ca-lfia條帶以檢測甲型流感病毒，與之前報道的催化活性材料相比，由于msio2的引入，所設(shè)計的復(fù)合納米酶具有更大的比表面積，這允許更多的pt顆粒在其表面生長，以提高催化性能。

51、（3）本發(fā)明所述介孔二氧化硅殼的納米酶標(biāo)簽進(jìn)行比色催化后，該納米酶標(biāo)簽對于甲型流感n蛋白的定性和定量檢測結(jié)果降低至為0.01和0.0089?ng·ml-1，其靈敏度大約是市售的基于膠體金納米顆粒（aunp）的lfia條帶的100倍；對于滅活的h1n1病毒的檢測，定量可低至33?copies·ml-1。

52、（4）本發(fā)明將所述介孔二氧化硅殼的納米酶標(biāo)簽應(yīng)用于咽拭子樣本的分析，在咽拭子樣本模擬實驗中顯示了較高的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性，“三合一”多功能納米酶可以快速、特異性、敏感地檢測甲型流感病毒，在病毒poct診斷方面具有巨大的潛力。