本發(fā)明涉及層析檢測，尤其是涉及一種熒光微球標記的大便隱血定量試劑條及其制備工藝。

背景技術：

1、目前，在醫(yī)療診斷領域，大便隱血檢測是一種重要的非侵入性檢測手段，用于篩查消化道出血和早期發(fā)現(xiàn)消化道腫瘤等疾病。傳統(tǒng)的隱血檢測方法主要依賴于化學試劑對血紅蛋白的反應，但這些方法往往存在靈敏度低、特異性不強等問題。隨著生物技術的發(fā)展，熒光標記技術因其高靈敏度和高特異性而被廣泛應用于生物醫(yī)學檢測領域。

2、現(xiàn)有的絕大部分抗體都是鼠源的，雖然使用鼠源抗體及抗鼠的質(zhì)控系統(tǒng)雖然有著較寬的檢測范圍，但是鼠源抗體容易和大便樣本中的蛋白發(fā)生非特異性結(jié)合，會存在相互干擾的可能，因此為了提高檢測靈敏度和特異性，現(xiàn)在市場上大便隱血的層析試劑條的標記方法大部分都采用獨立質(zhì)控系統(tǒng)：檢測區(qū)包被鼠源抗體、質(zhì)控區(qū)包被兔抗和雞抗系統(tǒng)，在結(jié)合墊上分別標記能識別分析物的鼠源抗體和能與質(zhì)控區(qū)系統(tǒng)結(jié)合的抗體，或者標記鼠源的血紅蛋白抗體及使用抗鼠的質(zhì)控抗體。在獨立質(zhì)控系統(tǒng)中，隨著待測物的濃度增加，檢測區(qū)信號增加，而質(zhì)控區(qū)信號基本不變，但由于質(zhì)控區(qū)信號不變，檢測范圍的調(diào)節(jié)完全依賴檢測區(qū)信號，當需要的檢測范圍較廣時，需要增加熒光微球用量及抗體用量，但是增加熒光微球用量后，對于大便這種會增加溶液黏稠度的樣本而言，會對樣本的跑條有一定影響，并且不斷提高檢測區(qū)峰信號對于干式熒光分析儀的性能要求越來越高，導致檢測整體成本逐步增大。

3、因此，有必要開發(fā)一種新的大便隱血檢測試紙條，在保證試紙條具備良好的靈敏度和特異性的同時，能夠更好地擴大試紙條的檢測范圍。

技術實現(xiàn)思路

1、為了擴大試紙條的檢測范圍，本技術提供一種熒光微球標記的大便隱血定量試劑條及其制備工藝。本技術提供的熒光微球標記的大便隱血定量試劑條，通過聯(lián)標工藝，顯著擴大了試紙條的檢測范圍，通過熒光微球標記血紅蛋白抗體i和雞igy抗體，實現(xiàn)了對大便隱血的高靈敏度和高特異性檢測，通過制備特定的保存液，提高了熒光微球標記溶液的穩(wěn)定性和反應活性，進一步增強了試劑條的檢測性能。

2、第一方面，本技術提供的一種熒光微球標記的大便隱血定量試劑條采用如下的技術方案：

3、一種熒光微球標記的大便隱血定量試劑條，包括樣品墊、結(jié)合墊、層析墊，所述結(jié)合墊是通過在纖維墊上涂抹熒光微球標記溶液制備而成的，所述熒光微球標記溶液的制備包括以下步驟：

4、步驟1：取熒光微球，加入4-5倍體積的活化液進行活化；

5、步驟2：活化完成后，離心，先棄上清液，然后加入4-5倍體積的偶聯(lián)液，再加入血紅蛋白抗體i偶聯(lián)2-3h后，接著加入雞igy抗體繼續(xù)偶聯(lián)1-2h；

6、步驟3：偶聯(lián)完成后，離心，棄上清液，加入4-5倍體積的保存液，得到熒光微球標記溶液，所述保存液是由20mm-50mm三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液、5wt％-10wt％海藻糖、0.5wt％-1wt％牛血清白蛋白、0.5wt％-1wt％皂莢糖膠、0.2wt％％-0.5wt％甲硫氨酸配制而成的。

7、上述技術方案中，本技術通過利用熒光微球標記血紅蛋白抗體i和雞igy，通過在標記過程中，優(yōu)先將血紅蛋白抗體i先進行偶聯(lián)，隨后再加入雞igy，使得試劑條可以采用聯(lián)標的方式進行檢測，待測物濃度增加，檢測區(qū)濃度升高而質(zhì)控區(qū)濃度下降，不容易受到大便黏度的影響，檢出限可更低，靈敏度更高，同時采用雞igy，不僅避免了抗體和大便樣本中的蛋白發(fā)生非特異性結(jié)合，進一步提高了檢測的特異性，而且因為雞igy是在血紅蛋白i偶聯(lián)2-3h后加入，作為質(zhì)控的同時又作為了熒光微球的封閉劑，省略了后續(xù)加入封閉液封閉的制備步驟，進一步優(yōu)化了制備方法，降低了制備成本。此外，本技術通過優(yōu)化保存液的配方，提高了熒光微球標記溶液的穩(wěn)定性和反應活性，使得試劑條在儲存過程中保持了良好的性能，從而確保了檢測的準確性和可靠性。

8、優(yōu)選的，所述活化液是由30mm-60mm啉乙磺酸緩沖液、8wt％-12wt％1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺、15wt％-20wt％n-羥基丁二酰亞胺配制而成的。

9、上述技術方案中，本技術通過優(yōu)化活化液的配方，提高了熒光微球的活化效率，從而增強了熒光微球標記溶液的反應活性。啉乙磺酸緩沖液能夠提供適宜的ph值環(huán)境，有利于熒光微球表面的活化反應；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺(edc)和n-羥基丁二酰亞胺(nhs)作為活化劑，可以促進熒光微球表面的活化反應，提高后續(xù)的偶聯(lián)效率。

10、優(yōu)選的，所述偶聯(lián)液是10mm-50mm硼酸緩沖液。

11、上述技術方案中，本技術通過選擇硼酸緩沖液作為偶聯(lián)液，為熒光微球和抗體的偶聯(lián)提供了穩(wěn)定的ph值環(huán)境，有利于熒光微球與抗體的偶聯(lián)反應，確保了偶聯(lián)過程的穩(wěn)定性。

12、優(yōu)選的，所述樣品墊是通過在纖維墊上涂抹樣品墊處理液制備而成的，所述樣品墊處理液是由0.005-0.01m磷酸鹽溶液、0.5wt％-2wt％吐溫20、0.5wt％-2wt％牛血清白蛋白、1wt％-2wt％蔗糖、0.5wt％-1.5wt％海藻糖和0.005wt％-0.02wt％proclin-300配制而成的。

13、上述技術方案中，本技術通過優(yōu)化樣品墊處理液的配方，提高了樣品墊對大便樣本的處理效果，從而增強了試劑條對大便樣本的跑條能力。

14、優(yōu)選的，所述層析墊分為檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)，所述檢測區(qū)是通過在硝酸纖維素膜上劃線檢測包被液制備而成的，所述檢測包被液包括血紅蛋白抗體ⅱ和包被緩沖底液，所述血紅蛋白抗體ⅱ的劃線濃度為1.5mg/ml-2.5mg/ml；所述質(zhì)控區(qū)是通過在硝酸纖維素膜上劃線質(zhì)控包被液制備而成的，所述質(zhì)控包被液包括抗雞抗體和包被緩沖底液，所述抗雞抗體的劃線濃度為1.5mg/ml-2.5mg/ml。

15、上述技術方案中，本技術通過在硝酸纖維素膜上分別劃線檢測包被液和質(zhì)控包被液，制備了具有檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)的層析墊。檢測區(qū)通過血紅蛋白抗體ⅱ的劃線，能夠特異性地結(jié)合大便樣本中的血紅蛋白，從而實現(xiàn)對大便隱血的檢測。質(zhì)控區(qū)則通過抗雞抗體的劃線，作為內(nèi)對照，確保試劑條的性能穩(wěn)定可靠。在制備過程中，通過精確控制劃線濃度，保證了試劑條的靈敏度和特異性。同時這樣的劃線方式也使得待測物濃度增加時，檢測區(qū)濃度能夠升高而質(zhì)控區(qū)濃度會下降，使得檢測結(jié)果不容易受到大便黏度的影響，檢出限可更低，靈敏度更高。

16、優(yōu)選的，所述包被緩沖底液是由10mm-50mm磷酸緩沖液、1wt％-10wt％海藻糖、0.2wt％-2wt％魚明膠配制而成的。

17、上述技術方案中，本技術通過選擇磷酸緩沖液作為包被緩沖底液，為抗體的包被提供了適宜的ph值環(huán)境，同時海藻糖和魚明膠的加入有助于保持抗體的活性和穩(wěn)定性，確保了試劑條在儲存和使用過程中的性能。

18、優(yōu)選的，所述熒光微球的粒徑為200nm-350nm。

19、上述技術方案中，本技術通過選擇粒徑在200nm-350nm之間的熒光微球，使得熒光微球在層析過程中具有良好的流動性和分散性，同時保證了其與抗體的偶聯(lián)效率。

20、優(yōu)選的，所述熒光微球標記溶液在結(jié)合墊上的涂抹量為2μl/cm-4μl/cm。

21、上述技術方案中，本技術通過將熒光微球標記溶液在結(jié)合墊上的涂抹量控制為2μl/cm-4μl/cm，確保了熒光微球在結(jié)合墊上的均勻分布，從而提高了試劑條的檢測靈敏度和重復性，有效避免因過量或不足而導致的檢測誤差，進一步優(yōu)化了試劑條的性能。

22、第二方面，本技術提供的一種熒光微球標記的大便隱血定量試劑條的制備方法采用如下的技術方案：

23、一種熒光微球標記的大便隱血定量試劑條的制備方法，包括：

24、取pvc底板，在pvc底板的平面上依次搭接樣品墊、結(jié)合墊、層析墊、吸水紙，其中層析墊的檢測區(qū)較質(zhì)控區(qū)更靠近結(jié)合墊，搭接完成后，密封，得熒光微球標記的大便隱血定量試劑條。

25、上述技術方案中，本技術通過依次搭接樣品墊、結(jié)合墊、層析墊、吸水紙，樣品墊首先接觸樣本，保證樣本中的目標物質(zhì)能夠順利地向后續(xù)傳遞，結(jié)合墊作為熒光微球標記溶液的載體，保證了熒光微球與目標物質(zhì)的有效結(jié)合，層析墊的檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)的設置，使得試劑條能夠?qū)Υ蟊銟颖局械碾[血進行特異性檢測，提高了檢測的準確性和可靠性。

26、綜上所述，本技術提供了一種熒光微球標記的大便隱血定量試劑條及其制備方法，該試劑條具有高特異性、高靈敏度、高穩(wěn)定性和低成本的特點，為臨床大便隱血的快速、準確檢測提供了新的技術手段。

27、綜上所述，本技術包括以下至少一種有益技術效果：

28、1.本技術通過采用聯(lián)標的方式進行檢測，后續(xù)待測物濃度增加時，檢測區(qū)濃度會升高而質(zhì)控區(qū)濃度會下降，從而減少了大便樣本黏度對檢測結(jié)果的影響，使得試紙條的檢出限可更低，靈敏度更高。

29、2.本技術采用雞igy，不僅避免了抗體和大便樣本中的蛋白發(fā)生非特異性結(jié)合，而且雞igy可以同時作為質(zhì)控和熒光微球的封閉劑，進一步優(yōu)化了制備方法，降低了制備成本。

30、3.本技術通過優(yōu)化保存液的配方，提高了熒光微球標記溶液的穩(wěn)定性和反應活性，使得試劑條在儲存過程中能夠保持了良好的性能，確保了試劑條在使用前的有效性。