本發(fā)明屬于毒素檢測，尤其涉及一種蓖麻毒素的免疫層析試劑盒和免疫層析試紙條檢測方法。

背景技術(shù)：

1、蓖麻毒素(ricin?toxin，rt)來源于大戟科蓖麻屬植物蓖麻，是一種植物毒素蛋白。其毒性強且易制備，因此，能夠在現(xiàn)場快速甄別rt，對維護國家安全及社會的長治久安具有重要意義。

2、rt由a和b兩條多肽鏈通多二硫鍵連接組成，b鏈無毒性但能介導(dǎo)a鏈進入細胞，a鏈主要發(fā)揮毒性作用。rt在結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性上與相思子毒素(abrin?toxin，at)十分相似，它們均屬于ⅱ型核糖體失活蛋白(ribosome-inactivating?protein，rip)，具有n-糖苷酶活性，可特異性且不可逆地水解生物的核糖體28s?rrna上的腺嘌呤(a4324)，導(dǎo)致核糖體無法與延長因子2結(jié)合，從而抑制核糖體的翻譯功能，抑制蛋白質(zhì)合成，進而發(fā)揮毒性作用。n-糖苷酶活性使得腺嘌呤脫落后會在相應(yīng)的位置形成堿基缺失位點(apurinic/apyrimidinic?site，ap?site)。發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)了at是具有ap裂解酶活性的，能夠在發(fā)揮n-糖苷酶活性后繼續(xù)作用于形成的ap位點并使得核酸鏈發(fā)生斷裂。此外，還依托該酶活性建立了快速靈敏的熒光信號檢測方法(專利號：zl?202311802616.6)。

3、毒素的酶活性不僅在生物體內(nèi)發(fā)揮重要的作用，還通常會被用作檢測手段的一種。由于失活了的毒素并不會存在危害，所以基于酶活性建立的檢測方法備受廣大學(xué)者的青睞。目前基于rt酶活性建立的檢測方法主要圍繞n-糖苷酶活性展開，通過質(zhì)譜技術(shù)等檢測腺嘌呤的含量實現(xiàn)檢測。這種方法的優(yōu)勢主要在于特異性強、靈敏度高，能夠檢測rt和at是否具有毒性，但是該方法從毒素與底物的孵育，再到上機檢測往往需要約2～5h的時間(孵育時間長短取決于樣本中毒素的含量)，耗時長，不利于快速檢測，且儀器昂貴、成本高。

4、若能利用rt的ap裂解酶活性與免疫層析試紙條技術(shù)結(jié)合，建立便攜式高靈敏度的檢測方法，對rt的檢測、鑒定和表征各種樣品基質(zhì)中rt具有十分重要的意義。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種蓖麻毒素的免疫層析試劑盒和免疫層析試紙條檢測方法，以解決現(xiàn)有rt檢測方法耗時長，不便于快速檢測等問題。

2、為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供了一種檢測蓖麻毒素的免疫層析試劑盒，包括免疫層析試紙條，標記熒光基團和生物素的寡核苷酸鏈底物；

4、所述寡核苷酸鏈為單鏈多聚腺嘌呤核苷酸，所述單鏈多聚腺嘌呤核苷酸中腺嘌呤的數(shù)量為6～15；

5、所述免疫層析試紙條包括依次搭接的樣品墊、纖維素膜和吸水墊，所述纖維素膜上從靠近樣品墊的一端開始依次設(shè)置有一條檢測線和一條質(zhì)控線，

6、所述檢測線上包被有能與生物素特異性結(jié)合的鏈霉親和素，所述質(zhì)控線上包被有綠色熒光微球。

7、優(yōu)選的，還包括緩沖液、bsa溶液和氨水。

8、優(yōu)選的，所述纖維素膜為hi-flowtmplus?membrane?180。

9、本發(fā)明還提供了一種蓖麻毒素的免疫層析試紙條檢測方法，包括以下步驟：

10、1)將標記熒光基團和生物素的寡核苷酸鏈底物、緩沖液、bsa溶液、待測樣品混合孵育后，加入氨水終止反應(yīng)得到反應(yīng)液；

11、2)將反應(yīng)液加入到免疫層析試紙條上，避光孵育，檢測熒光信號值，根據(jù)最終樣品熒光信號值與陰性對照最終熒光信號值的差值確定是否存在蓖麻毒素；

12、所述待測樣品使用抗體包被的磁珠進行富集；

13、所述樣品的熒光信號值低于陰性對照熒光信號值-3倍標準差即可判定為存在蓖麻毒素。

14、優(yōu)選的，步驟1)所述標記熒光基團和生物素的寡核苷酸鏈底物的濃度為0.01μm～25μm。

15、優(yōu)選的，步驟1)所述緩沖液為檸檬酸銨緩沖液，所述檸檬酸銨緩沖液的濃度為2～3mm。

16、優(yōu)選的，步驟1)所述氨水的濃度為50～400mm。

17、優(yōu)選的，所述抗體包被的磁珠為dynabeadstm。

18、優(yōu)選的，步驟2)所述避光孵育的溫度為22～27℃，所述避光孵育的時間為10～20min。

19、優(yōu)選的，步驟1)所述bsa的濃度為80～120μg/ml；所述標記熒光基團和生物素的寡核苷酸鏈底物、緩沖液、bsa溶液、待測樣品的體積比為7～9：7～9：7～9：7～9；

20、所述孵育的溫度為55～62℃，所述孵育的時間為40～80min。

21、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

22、本發(fā)明自行設(shè)計單鏈dna反應(yīng)底物序列，在兩端進行fam熒光基團和生物素修飾。并首次將at的ap裂解酶活性與免疫層析技術(shù)相結(jié)合，利用at的ap裂解酶活性并使用核酸底物作為“抗原”，通過向試紙條t線固定鏈霉親和素實現(xiàn)對反應(yīng)底物的捕獲，通過消線法實現(xiàn)對at的檢測。反應(yīng)原理是at首先發(fā)揮其n-糖苷酶活性，作用于寡核苷酸鏈上的腺嘌呤，然后進一步發(fā)揮ap裂解酶活性使得寡核苷酸底物斷裂。陰性樣本層析時，底物上的生物素會被t線上固定的鏈霉親和素截留，t線具有較高的熒光信號值。陽性樣本層析時，含生物素的斷裂的底物會被t線上固定的鏈霉親和素截留，含熒光基團的斷裂的底物會游走，進而使得t線的熒光信號值降低(如圖1所示)。

23、本發(fā)明方法反應(yīng)體系組成成分簡單，只包括牛血清白蛋白、檸檬酸銨緩沖液和進行了熒光基團與生物素修飾的寡核苷酸底物。本發(fā)明通過對反應(yīng)體系的組成成分、濃度，反應(yīng)底物的長度，試紙條nc膜的種類、t線固定抗體種類與濃度等進行優(yōu)化，構(gòu)建了完整的試紙條檢測體系。該檢測方法只需前期在59℃下恒溫孵育1h即可完成檢測。樣本毒素直接反應(yīng)，不利用抗體包被的磁珠進行富集時，該方法檢測靈敏度可達到1.65ng/ml；使用包被抗體的磁珠進行富集后，未見與相思子毒素樣本存在交叉反應(yīng)，檢測靈敏度可達到0.17ng/ml。此外，將其應(yīng)用于牛奶模擬樣本的檢測，靈敏度可達1.53ng/ml。本發(fā)明的反應(yīng)體系成分及反應(yīng)條件簡單，反應(yīng)時間短，且不需要昂貴的檢測儀器和復(fù)雜的專業(yè)操作，突破了目前rt檢測方法的技術(shù)壁壘，可用于現(xiàn)場快速篩查以及體外rt中毒樣本的快速檢測。

技術(shù)特征：

1.一種檢測蓖麻毒素的免疫層析試劑盒，其特征在于，包括免疫層析試紙條，標記熒光基團和生物素的寡核苷酸鏈底物；

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫層析試劑盒，其特征在于，還包括緩沖液、bsa溶液和氨水。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫層析試劑盒，其特征在于，所述纖維素膜為hi-flowtmplusmembrane?180。

4.一種蓖麻毒素的免疫層析試紙條檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的免疫層析試紙條檢測方法，其特征在于，步驟1)所述標記熒光基團和生物素的寡核苷酸鏈底物的濃度為0.01μm～25μm。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的免疫層析試紙條檢測方法，其特征在于，步驟1)所述緩沖液為檸檬酸銨緩沖液，所述檸檬酸銨緩沖液的濃度為2～3mm。

7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的免疫層析試紙條檢測方法，其特征在于，步驟1)所述氨水的濃度為50～400mm。

8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的免疫層析試紙條檢測方法，其特征在于，所述抗體包被的磁珠為dynabeadstm。

9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的免疫層析試紙條檢測方法，其特征在于，步驟2)所述避光孵育的溫度為22～27℃，所述避光孵育的時間為10～20min。

10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的免疫層析試紙條檢測方法，其特征在于，步驟1)所述bsa的濃度為80～120μg/ml；所述標記熒光基團和生物素的寡核苷酸鏈底物、緩沖液、bsa溶液、待測樣品的體積比為7～9：7～9：7～9：7～9；

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種蓖麻毒素的免疫層析試劑盒和免疫層析試紙條檢測方法，屬于毒素檢測技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明將標記熒光基團和生物素的寡核苷酸鏈底物、緩沖液、BSA溶液、待測樣品混合孵育后，加入氨水終止反應(yīng)得到反應(yīng)液；將反應(yīng)液加入到免疫層析試紙條上，避光孵育，檢測熒光信號值，根據(jù)最終樣品熒光信號值與陰性對照最終熒光信號值的差值確定是否存在蓖麻毒素；所述待測樣品使用抗體包被的磁珠進行富集；所述樣品的熒光信號值低于陰性對照熒光信號值?3倍標準差即可判定為存在蓖麻毒素。本發(fā)明檢測方法與相思子毒素樣本不存在交叉反應(yīng)，檢測靈敏度可達到0.17ng/mL。將其應(yīng)用于牛奶模擬樣本的檢測，靈敏度可達1.53ng/mL。

技術(shù)研發(fā)人員：辛文文,柳婷婷,李佳欣,康琳,岳楠,董理娜,王岑,高姍,王菁,王景林
受保護的技術(shù)使用者：中國人民解放軍軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/2