本發(fā)明屬于微量蛋白免疫學(xué)定性檢測(cè)領(lǐng)域，特別是涉及一種用于b型肉毒神經(jīng)毒素的檢測(cè)方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、肉毒毒素是由肉毒梭狀芽胞桿菌生長(zhǎng)、繁殖過(guò)程中產(chǎn)生的細(xì)菌外毒素，根據(jù)抗原性分為7個(gè)型，即a、b、c、d、e、f、g。肉毒毒素具有強(qiáng)烈毒性，肉毒毒素污染的食品可致食物中毒，嚴(yán)重者可致命，造成人類(lèi)肉毒中毒的型別主要有a、b、e、f型，因此肉毒毒素檢驗(yàn)是食品衛(wèi)生檢驗(yàn)的重要內(nèi)容，進(jìn)行肉毒毒素的防治研究對(duì)國(guó)家生物安全、社會(huì)衛(wèi)生安全都具有重要意義。免疫學(xué)檢測(cè)是肉毒毒素檢測(cè)的主要方法。

2、臨床上肉毒中毒搶救的關(guān)鍵是及早做出正確診斷，這關(guān)系到能否挽救生命，對(duì)癥狀的診斷僅為參考，決定性的診斷是中毒食物的定性檢測(cè)，對(duì)中毒食物的定性檢測(cè)是診斷的關(guān)鍵，對(duì)中毒食物中毒素的型別鑒定是做出治療方案的關(guān)鍵。在毒素的實(shí)驗(yàn)室研究領(lǐng)域除需對(duì)樣品的定性檢測(cè)和鑒別檢測(cè)外還需純度、穩(wěn)定性等方面檢測(cè)。

3、現(xiàn)有的常規(guī)技術(shù)首先為免疫中和毒素基礎(chǔ)上的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物法，該方法的缺陷是：1)檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，通常2-4天；2)使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，在實(shí)驗(yàn)倫理方面面臨壓力，勢(shì)必淘汰；3)動(dòng)物存在個(gè)體差異導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)誤差較大；4)型別鑒定使用的是診斷血清，靈敏度較低，結(jié)果以小鼠死亡情況和癥狀判斷，需在2-4天內(nèi)對(duì)小鼠持續(xù)觀察，如不能持續(xù)觀察則可能錯(cuò)過(guò)小鼠癥狀觀察，亦存在小鼠因其它原因死亡(非特異性死亡)，因此對(duì)于毒素的鑒別效果不佳。第二種常用檢測(cè)技術(shù)是elisa夾心法，但elisa方法缺陷在于：靈敏度僅能達(dá)到ng級(jí)，對(duì)于pg級(jí)的毒素?zé)o法檢出，而肉毒毒素因毒性極強(qiáng)，極微量毒素即可引起中毒，而產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)的毒素量低于納克級(jí)，elisa夾心法對(duì)于低劑量毒素檢出率較低。其次，elisa方法僅能對(duì)毒素總體分子檢測(cè)，得出宏觀判斷，無(wú)法對(duì)毒素分子各部分結(jié)構(gòu)具體分析，對(duì)毒素的純度，穩(wěn)定性等重要性質(zhì)無(wú)法檢出，不能完全滿(mǎn)足肉毒毒素研究的需要。

4、雖然還存在肉毒毒素的其它分析方法，但僅用于毒素的結(jié)構(gòu)分析等理論性較強(qiáng)的領(lǐng)域，并不是臨床和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的常規(guī)方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決上述現(xiàn)有技術(shù)中的至少部分技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明開(kāi)發(fā)了一種基于夾心法的毛細(xì)管免疫電泳檢測(cè)技術(shù)，該方法能夠達(dá)到pg級(jí)靈敏度。具體地，本發(fā)明包括以下內(nèi)容。

2、本發(fā)明的第一方面，提供一種用于b型肉毒神經(jīng)毒素的檢測(cè)方法，其包括在毛細(xì)管中以捕獲抗體、待測(cè)樣本和檢測(cè)抗體形成夾心復(fù)合物并催化檢測(cè)液產(chǎn)生能夠被檢測(cè)器捕捉的信號(hào)，從而確定b型肉毒神經(jīng)毒素的存在和/或進(jìn)行b型肉毒神經(jīng)毒素的定量，其中，所述捕獲抗體能夠靶向b型肉毒神經(jīng)毒素，所述捕獲抗體包含氨基酸序列分別如gfafssyd、issggsst和arqafytydgtamdy所示的重鏈cdr1-3，和/或氨基酸序列分別如qsivhnngdty、kvs和fqgshipwt所示的輕鏈cdr1-3。

3、在某些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明所述的用于b型肉毒神經(jīng)毒素的檢測(cè)方法，其中，所述方法包括以下步驟：

4、(1)將捕獲抗體、待測(cè)樣本、檢測(cè)抗體和檢測(cè)液分別加入毛細(xì)管免疫電泳裝置的檢測(cè)板中；

5、(2)使所述待測(cè)樣本與捕獲抗體在毛細(xì)管組件內(nèi)結(jié)合后進(jìn)一步與所述檢測(cè)抗體結(jié)合形成復(fù)合物，并以不同的區(qū)帶通過(guò)毛細(xì)管；

6、(3)使所述檢測(cè)抗體催化檢測(cè)液，根據(jù)熒光信號(hào)確定b型肉毒神經(jīng)毒素的存在和/或定量。

7、在某些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明所述的用于b型肉毒神經(jīng)毒素的檢測(cè)方法，其中，所述檢測(cè)抗體具有(i)-(iii)所示的任意一種氨基酸序列：

8、(i)包含seq?id?no.1所示的重鏈氨基酸序列和/或seq?id?no.2所示的輕鏈氨基酸序列；

9、(ii)與(i)所示的氨基酸序列具有至少90％同源性，且具有相同功能的氨基酸序列；

10、(iii)與(i)或(ii)所示的氨基酸序列經(jīng)修飾、取代、缺失或添加一個(gè)或多于一個(gè)氨基酸獲得的且具有相同功能的氨基酸序列。

11、在某些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明所述的用于b型肉毒神經(jīng)毒素的檢測(cè)方法，其中，所述檢測(cè)抗體為酶標(biāo)抗體，所述酶包括辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶或β-半乳糖苷酶。

12、在某些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明所述的用于b型肉毒神經(jīng)毒素的檢測(cè)方法，其中，所述檢測(cè)液包括化學(xué)發(fā)光劑或顯色劑，所述辣根過(guò)氧化物酶對(duì)應(yīng)的檢測(cè)液包括魯米諾、鄰苯二胺、四甲基聯(lián)苯胺、5-氨基水楊酸和2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽中的至少一種，所述堿性磷酸酶對(duì)應(yīng)的檢測(cè)液包括amppd、吖啶酯和4-甲基傘形酮磷酸酯中的至少一種，所述β-半乳糖苷酶對(duì)應(yīng)的檢測(cè)液包括5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-半乳糖苷、對(duì)-硝基苯磷酸脂和4-甲基傘酮基-r-d半乳糖苷中的至少一種。

13、在某些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明所述的用于b型肉毒神經(jīng)毒素的檢測(cè)方法，其中，所述捕獲抗體和所述檢測(cè)抗體的濃度為0.1-50mg/ml。

14、本發(fā)明的第二方面，提供一種用于b型肉毒神經(jīng)毒素的毛細(xì)管免疫電泳檢測(cè)試劑盒，其包括：

15、i.捕獲抗體溶液，其中，所述捕獲抗體能夠靶向b型肉毒神經(jīng)毒素，所述捕獲抗體包含氨基酸序列分別如gfafssyd、issggsst和arqafytydgtamdy所示的重鏈cdr1-3，和/或氨基酸序列分別如qsivhnngdty、kvs和fqgshipwt所示的輕鏈cdr1-3；

16、ii.檢測(cè)抗體溶液；

17、iii.檢測(cè)液。

18、在某些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明所述的用于b型肉毒神經(jīng)毒素的毛細(xì)管免疫電泳檢測(cè)試劑盒，其中，所述檢測(cè)液為等體積的魯米諾和過(guò)氧化氫的混合溶液。

19、在某些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明所述的用于b型肉毒神經(jīng)毒素的毛細(xì)管免疫電泳檢測(cè)試劑盒，其中，所述檢測(cè)試劑盒進(jìn)一步包括5×master?mix、sample?buffer。

20、本發(fā)明的第三方面，提供根據(jù)本發(fā)明所述的方法，或所述的試劑盒的應(yīng)用，其中，所述應(yīng)用包括b型肉毒神經(jīng)毒素生產(chǎn)或b型肉毒神經(jīng)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量控制、監(jiān)測(cè)。

21、本發(fā)明的方法檢測(cè)時(shí)間短，可在6h檢出結(jié)果，同時(shí)作為定性檢測(cè)法靈敏度高，達(dá)到皮克級(jí)，比其他方法高出1-2個(gè)數(shù)量級(jí)，對(duì)于微量毒素樣品檢測(cè)優(yōu)勢(shì)明顯。相對(duì)于使用抗血清檢測(cè)的動(dòng)物法，采用單克隆抗體對(duì)檢測(cè)特異性高，不論是用于科研檢測(cè)和食品衛(wèi)生檢驗(yàn)均有利于準(zhǔn)確決策，且相對(duì)于動(dòng)物法誤差小。此外，本發(fā)明產(chǎn)生的肉毒神經(jīng)毒素雙抗體夾心反應(yīng)特征峰可用于肉毒毒素和肉毒神經(jīng)毒素的穩(wěn)定性檢測(cè)，對(duì)于肉毒毒素產(chǎn)品生產(chǎn)、質(zhì)量控制、新品研發(fā)、檢定用標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)控和監(jiān)測(cè)及市場(chǎng)監(jiān)督起到其它方法無(wú)法替代的作用。因此，本發(fā)明可用于指導(dǎo)建立毒素免疫檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，推動(dòng)毛細(xì)管免疫檢測(cè)技術(shù)成為新的肉毒毒素檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法。

技術(shù)特征：

1.一種用于b型肉毒神經(jīng)毒素的檢測(cè)方法，其特征在于，包括在毛細(xì)管中以捕獲抗體、待測(cè)樣本和檢測(cè)抗體形成夾心復(fù)合物并催化檢測(cè)液產(chǎn)生能夠被檢測(cè)器捕捉的信號(hào)，從而確定b型肉毒神經(jīng)毒素的存在和/或進(jìn)行b型肉毒神經(jīng)毒素的定量，其中，所述捕獲抗體能夠靶向b型肉毒神經(jīng)毒素，所述捕獲抗體包含氨基酸序列分別如gfafssyd、issggsst和arqafytydgtamdy所示的重鏈cdr1-3，和/或氨基酸序列分別如qsivhnngdty、kvs和fqgshipwt所示的輕鏈cdr1-3。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于b型肉毒神經(jīng)毒素的檢測(cè)方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于b型肉毒神經(jīng)毒素的檢測(cè)方法，其特征在于，所述檢測(cè)抗體具有(i)-(iii)所示的任意一種氨基酸序列：

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于b型肉毒神經(jīng)毒素的檢測(cè)方法，其特征在于，所述檢測(cè)抗體為酶標(biāo)抗體，用于標(biāo)記的酶包括辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶或β-半乳糖苷酶。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于b型肉毒神經(jīng)毒素的檢測(cè)方法，其特征在于，所述檢測(cè)液包括化學(xué)發(fā)光劑或顯色劑，所述辣根過(guò)氧化物酶對(duì)應(yīng)的檢測(cè)液包括魯米諾、鄰苯二胺、四甲基聯(lián)苯胺、5-氨基水楊酸和2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽中的至少一種，所述堿性磷酸酶對(duì)應(yīng)的檢測(cè)液包括amppd、吖啶酯和4-甲基傘形酮磷酸酯中的至少一種，所述β-半乳糖苷酶對(duì)應(yīng)的檢測(cè)液包括5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-半乳糖苷、對(duì)-硝基苯磷酸脂和4-甲基傘酮基-r-d半乳糖苷中的至少一種。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于b型肉毒神經(jīng)毒素的檢測(cè)方法，其特征在于，所述捕獲抗體和所述檢測(cè)抗體的濃度為0.1-50mg/ml。

7.一種用于b型肉毒神經(jīng)毒素的毛細(xì)管免疫電泳檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括：

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于b型肉毒神經(jīng)毒素的毛細(xì)管免疫電泳檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述檢測(cè)液為魯米諾和過(guò)氧化氫的混合溶液。

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于b型肉毒神經(jīng)毒素的毛細(xì)管免疫電泳檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述檢測(cè)試劑盒進(jìn)一步包括master?mix和sample?buffer。

10.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的方法，或根據(jù)權(quán)利要求7-9任一項(xiàng)所述的試劑盒的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用包括b型肉毒神經(jīng)毒素生產(chǎn)或b型肉毒神經(jīng)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量控制、監(jiān)測(cè)。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開(kāi)一種用于B型肉毒神經(jīng)毒素的檢測(cè)方法及應(yīng)用。本發(fā)明的方法檢測(cè)時(shí)間短，作為定性檢測(cè)法靈敏度高，達(dá)到皮克級(jí)，對(duì)于微量毒素樣品檢測(cè)優(yōu)勢(shì)明顯。相對(duì)于使用抗血清檢測(cè)的動(dòng)物法，采用單克隆抗體對(duì)檢測(cè)特異性高，不論是用于科研檢測(cè)和食品衛(wèi)生檢驗(yàn)均有利于準(zhǔn)確決策，且相對(duì)于動(dòng)物法誤差小。此外，本發(fā)明產(chǎn)生的肉毒神經(jīng)毒素雙抗體夾心反應(yīng)特征峰可用于肉毒神經(jīng)毒素的穩(wěn)定性檢測(cè)，對(duì)于肉毒毒素產(chǎn)品生產(chǎn)、質(zhì)量控制、新品研發(fā)、檢定用標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)控和監(jiān)測(cè)及市場(chǎng)監(jiān)督起到其它方法無(wú)法替代的作用。因此，本發(fā)明可用于指導(dǎo)建立毒素免疫檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，推動(dòng)毛細(xì)管免疫檢測(cè)技術(shù)成為新的肉毒毒素檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法。

技術(shù)研發(fā)人員：陸儉,周易,王怡之,張若暉,馬亞峰,張政,朱俐
受保護(hù)的技術(shù)使用者：蘭州生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/2