本發(fā)明涉及但不限于中藥制劑質(zhì)量控制，具體地涉及?一種消銀膠囊/顆粒的hplc特征圖譜的建立方法及其特征圖譜。

背景技術(shù)：

1、消銀膠囊（國藥準(zhǔn)字：z20000110）是一種中成藥，已收錄于2020年版《中國藥典》第一部。消銀顆粒（國藥準(zhǔn)字：z20000019）同樣為中成藥，其藥效與消銀膠囊相同，具有清熱涼血、養(yǎng)血潤燥、祛風(fēng)止癢的功效，主要用于治療血熱風(fēng)燥型和血虛風(fēng)燥型白疕。該藥物的處方由地黃、牡丹皮、赤芍、當(dāng)歸、苦參、金銀花、玄參、牛蒡子、蟬蛻、白鮮皮、防風(fēng)、大青葉、紅花等13味中藥材組成。其中，牛蒡子具有疏散風(fēng)熱、透疹消腫的作用，苦參則能清熱燥濕、殺蟲止癢，配合其他藥物，共同發(fā)揮清熱涼血、養(yǎng)血潤燥、祛風(fēng)止癢的綜合療效。

2、銀屑病，俗稱牛皮癬，是一種常見的慢性、復(fù)發(fā)性、炎癥性皮膚病，其特征是皮膚表皮細(xì)胞的異常增生，導(dǎo)致紅斑、鱗屑、瘙癢等癥狀的出現(xiàn)。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國銀屑病的發(fā)病率約為0.47%至0.5%。這一數(shù)據(jù)表明，在中國大約每200至250人中就有1人患有銀屑病。銀屑病的治療方法多樣，包括局部治療、系統(tǒng)性藥物治療、光療以及生物制劑等。盡管現(xiàn)有治療手段能夠有效緩解銀屑病的癥狀，但多數(shù)療法存在副作用大、耐藥性及復(fù)發(fā)等問題，因此，尋找安全、有效、持久的治療方法仍是臨床研究的重點(diǎn)。消銀膠囊和消銀顆粒的研發(fā)基于中醫(yī)藥理論，針對銀屑病的濕熱、瘀血、毒素等病因，注重清熱解毒、活血化瘀和祛濕止癢的治療原則。通過精選多種中藥材，并結(jié)合現(xiàn)代制藥技術(shù)，旨在從根本上緩解銀屑病癥狀，減少復(fù)發(fā)的可能性。相比某些西藥和生物制劑可能帶來的嚴(yán)重副作用，消銀膠囊和顆粒在安全性方面具有顯著優(yōu)勢。作為中藥制劑，其處方成分天然，毒副作用小，尤其適合需要長期管理的銀屑病患者。此外，膠囊或顆粒劑型不僅服用方便，藥物穩(wěn)定性好，也有助于患者堅(jiān)持治療，提高治療依從性。

3、在現(xiàn)行2020年版《中國藥典》的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，消銀膠囊僅以芍藥苷和苦參堿作為含量測定的指標(biāo)。然而，消銀膠囊的處方中包含多種藥材，化學(xué)成分復(fù)雜，僅依賴單一化合物的鑒別或含量測定，難以全面反映其物質(zhì)基礎(chǔ)及化學(xué)成分信息，進(jìn)而無法實(shí)現(xiàn)對其內(nèi)在質(zhì)量的全面控制。此外，因?yàn)轭w粒劑型的制備過程中，活性成分的提取和濃縮程度較低，而膠囊劑型通常設(shè)計(jì)用于封閉和保護(hù)有效成分，可能在加工和儲存中更有效地保持其活性成分，導(dǎo)致其含量較高。因此在制備消銀顆粒供試品溶液時(shí)，超聲后進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)操作，再加入適量甲醇進(jìn)行復(fù)溶，以確保溶液的穩(wěn)定性，促使藥效成分充分溶出。中藥特征圖譜作為一種具有整體性、宏觀性和模糊分析等特點(diǎn)的方法，能夠通過描述中藥的整體特征，實(shí)現(xiàn)對中藥整體質(zhì)量的有效控制，從而彌補(bǔ)傳統(tǒng)單一成分檢測方法的不足。因此，中藥指紋圖譜技術(shù)為消銀膠囊/顆粒的質(zhì)量控制提供了新的思路和解決方案，但是，目前未見有文獻(xiàn)和專利報(bào)道有關(guān)消銀膠囊/顆粒hplc特征指紋圖譜的構(gòu)建。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、鑒于消銀膠囊/顆粒成分復(fù)雜，針對現(xiàn)有消銀膠囊/顆粒質(zhì)量評價(jià)方法僅依賴單一化合物的鑒別或含量測定，忽略了成分之間的相互作用和整體效果導(dǎo)致現(xiàn)有質(zhì)量評價(jià)方法存在缺乏系統(tǒng)性評價(jià)、穩(wěn)定性評價(jià)不足以及無法全面反映藥效物質(zhì)基礎(chǔ)等問題。本發(fā)明旨在于提供一種消銀膠囊/顆粒的hplc特征指紋圖譜及其構(gòu)建和應(yīng)用。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供一種消銀膠囊/顆粒的hplc標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的構(gòu)建方法，包括：

4、s1，以不同批次消銀膠囊/顆粒作為供試品制備供試品消銀膠囊/顆粒溶液；以綠原酸、沒食子酸、羥基紅花黃色素a、芍藥內(nèi)酯苷、蘆丁、異牡荊素、5-o-甲基維斯阿米醇苷、3，5-二-o-咖啡?？鼘幩帷?，5-二-o-咖啡酰奎寧酸、苯甲酸、槲皮素、丹皮酚、苦參酮、黃柏酮為對照品，制備單一對照品溶液；

5、s2，在相同的條件下對供試品消銀膠囊/顆粒溶液和對照品溶液進(jìn)行高效液相色譜分析，記錄相應(yīng)的色譜圖；

6、s3，將s2中獲得的供試品色譜圖和對照品色譜圖導(dǎo)入中藥色譜特征圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)并進(jìn)行相似度分析，確認(rèn)結(jié)果的可靠性；

7、s4，根據(jù)s2中獲得的供試品色譜圖進(jìn)行高分辨質(zhì)譜分析，得到總離子流圖；根據(jù)總離子流圖和s2中獲得的供試品色譜圖出峰情況進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，得到各化學(xué)成分的質(zhì)譜結(jié)果圖；

8、s5，對s2中獲得的供試品色譜圖和對照品色譜圖，s4中獲得的總離子流圖以及各化學(xué)成分的質(zhì)譜圖進(jìn)行比對，得到由共有特征峰構(gòu)成的消銀膠囊/顆粒的hplc特征指紋圖譜。

9、s1中，取不同批次消銀膠囊/顆粒內(nèi)容物，加甲醇溶液，超聲提取，過濾，微孔濾膜過濾，獲得供試品消銀膠囊/顆粒溶液。

10、進(jìn)一步地，每25?ml甲醇溶液中，含有1.0?g消銀膠囊內(nèi)容物，超聲提取，過濾，微孔濾膜過濾，獲得供試品消銀膠囊溶液；每25?ml甲醇溶液中，含有2.0?g消銀顆粒內(nèi)容物，超聲提取，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状际谷芙猓⒖诪V膜過濾，獲得供試品消銀顆粒溶液。

11、更進(jìn)一步地，所述甲醇溶液為純甲醇溶液；超聲提取30?min；0.45?μm微孔濾膜過濾。

12、s1中，以綠原酸、沒食子酸、羥基紅花黃色素a、芍藥內(nèi)酯苷、蘆丁、異牡荊素、5-o-甲基維斯阿米醇苷、3，5-二-o-咖啡?？鼘幩?、4，5-二-o-咖啡酰奎寧酸、苯甲酸、槲皮素、丹皮酚、苦參酮、黃柏酮為對照品，溶于甲醇溶液，制備單一對照品溶液。

13、進(jìn)一步地，s1中，綠原酸單一對照品溶液中，每1?ml甲醇溶液中含綠原酸88?μg；沒食子酸單一對照品溶液中，每1?ml甲醇溶液中含沒食子酸75?μg；羥基紅花黃色素a?單一對照品溶液中，每1?ml甲醇溶液中含羥基紅花黃色素a?96?μg；芍藥內(nèi)酯苷單一對照品溶液中，每1?ml甲醇溶液中含芍藥內(nèi)酯苷83?μg；蘆丁單一對照品溶液中，每1?ml甲醇溶液中含蘆丁68?μg；異牡荊素單一對照品溶液中，每1?ml甲醇溶液中含異牡荊素95?μg；5-o-甲基維斯阿米醇苷單一對照品溶液中，每1?ml甲醇溶液中含5-o-甲基維斯阿米醇苷123?μg；3，5-二-o-咖啡?？鼘幩釂我粚φ掌啡芤褐?，每1?ml甲醇溶液中含3，5-二-o-咖啡?？鼘幩?07μg；4，5-二-o-咖啡?？鼘幩釂我粚φ掌啡芤褐?，每1?ml甲醇溶液中含4，5-二-o-咖啡?？鼘幩?9?μg；苯甲酸單一對照品溶液中，每1?ml甲醇溶液中含苯甲酸85?μg；槲皮素單一對照品溶液中，每1?ml甲醇溶液中含槲皮素79?μg；丹皮酚單一對照品溶液中，每1?ml甲醇溶液中含丹皮酚64?μg；苦參酮單一對照品溶液中，每1?ml甲醇溶液中含苦參酮136?μg；黃柏酮單一對照品溶液中，每1?ml甲醇溶液中含黃柏酮142?μg。

14、s2中，所述高效液相色譜檢測波長為210～290?nm，柱溫為25～35℃，流速為0.6～1.0?ml/min。

15、進(jìn)一步地，檢測波長為225?nm，柱溫為30℃，流速為1.0?ml/min，進(jìn)樣量為10?μl。

16、s2中，所述高效液相色譜測定條件為：shim-pack?vp-ods（250?mm×4.6?mm，5?μm）色譜柱；流動相為乙腈-0.1%磷酸，梯度洗脫程序如下：

17、。

18、

19、s3具體為：將s2中獲得的不同批次消銀膠囊/顆粒供試品溶液色譜圖和對照品色譜圖導(dǎo)入中藥色譜特征圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)；選擇不同批次消銀膠囊/顆粒供試品溶液的色譜圖中均存在的色譜峰作為共有峰，用平均值計(jì)算法生成消銀膠囊/顆粒的對照圖譜，計(jì)算各共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積；經(jīng)數(shù)據(jù)導(dǎo)入、多點(diǎn)矯正和數(shù)據(jù)匹配，進(jìn)行相似度分析；獲得不同批次消銀膠囊供試品溶液的色譜圖與共有峰模式之間的相似度結(jié)果表并導(dǎo)出；根據(jù)相似度結(jié)果表及消銀膠囊/顆粒供試品溶液的色譜圖，確認(rèn)結(jié)果的可靠性。

20、s4中，所述高分辨質(zhì)譜的檢測條件為：電噴霧電離，噴霧電壓為3500?v，鞘氣流速為40?arb，輔助氣流速為10?arb，毛細(xì)管溫度為300℃，輔助氣溫度為300℃，掃描模式為全掃描模式，質(zhì)荷比掃描范圍m/z為100-1500。

21、s5具體為：根據(jù)s2中獲得的供試品色譜圖和對照品色譜圖，結(jié)合s4中由高分辨質(zhì)譜得到的總離子流圖以及化學(xué)成分的質(zhì)譜結(jié)果圖進(jìn)行比對，以4號峰綠原酸為參照峰，指認(rèn)出色譜圖中1號峰為沒食子酸、5號峰為羥基紅花黃色素a、6號峰為芍藥內(nèi)酯苷、8號峰為蘆丁、9號峰為異牡荊素、10號峰為5-o-甲基維斯阿米醇苷、11號峰為3，5-二-o-咖啡酰奎寧酸、12號峰為4，5-二-o-咖啡?？鼘幩帷?3號峰為苯甲酸、15號峰為槲皮素、19號峰為丹皮酚、21號峰為苦參酮、22號峰為黃柏酮得到消銀膠囊/顆粒的特征圖譜。

22、進(jìn)一步地，得到消銀膠囊/顆粒的特征圖譜后，對消銀膠囊/顆粒的特征圖譜進(jìn)行歸屬性分析。

23、更進(jìn)一步地，對消銀膠囊/顆粒特征指紋圖譜中14個(gè)特征峰所對應(yīng)的化學(xué)成分進(jìn)行了歸屬分析，其中，1號峰沒食子酸是赤芍、當(dāng)歸和紅花的共有峰；4號峰綠原酸是當(dāng)歸和牛蒡子的共有峰；8號峰蘆丁是金銀花和紅花的共有峰；6號峰芍藥內(nèi)酯苷來源于赤芍；19號峰丹皮酚來源于牡丹皮；21號峰苦參酮來源于苦參；11號峰3，5-二-o-咖啡?？鼘幩帷?2號峰4，5-二-o-咖啡?？鼘幩醽碓从诮疸y花；22號峰黃柏酮來源于白鮮皮；10號峰5-o-甲基維斯阿米醇苷來源于防風(fēng)；9號峰異牡荊素來源于大青葉；5號峰羥基紅花黃色素a、15號峰槲皮素來源于紅花。

24、本發(fā)明提供上述構(gòu)建方法獲得的消銀膠囊/顆粒hplc特征指紋圖譜。

25、本發(fā)明提供一種檢測消銀膠囊/顆粒質(zhì)量的方法，利用上述構(gòu)建方法獲得的消銀膠囊/顆粒hplc特征指紋圖譜檢測消銀膠囊/顆粒樣品的質(zhì)量。

26、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的技術(shù)方案取得了以下有益技術(shù)效果：

27、本發(fā)明提供的消銀膠囊/顆粒hplc標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的構(gòu)建方法，通過高效液相色譜技術(shù)，結(jié)合梯度洗脫和特定的色譜條件，能夠精確分離和檢測消銀膠囊/顆粒中的多種活性成分，精密度高、重現(xiàn)性好，且分離度良好，穩(wěn)定性高。采用該方法構(gòu)建的特征指紋圖譜，能夠確保不同批次消銀膠囊/顆粒之間的一致性和穩(wěn)定性，為消銀膠囊/顆粒的質(zhì)量控制提供了一個(gè)可靠的參考標(biāo)準(zhǔn)，通過與特征指紋圖譜的相似度評價(jià)，可快速、準(zhǔn)確地判斷樣品的質(zhì)量，確保不同批次產(chǎn)品之間的一致性，有助于保證產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性和可靠性，與傳統(tǒng)的質(zhì)量檢測方法相比，hplc特征指紋圖譜技術(shù)具有更高的檢測效率，可在短時(shí)間內(nèi)檢測大量樣品，并自動生成檢測報(bào)告，可全面、客觀、準(zhǔn)確的檢測和評價(jià)消銀膠囊（顆粒）的質(zhì)量，為保證臨床療效具有重要意義。

28、本發(fā)明構(gòu)建的消銀膠囊/顆粒特征指紋圖譜，實(shí)現(xiàn)了26個(gè)色譜共有峰的表征，并對其中14個(gè)主要色譜峰進(jìn)行了明確的化學(xué)指認(rèn)，覆蓋牡丹皮、赤芍、當(dāng)歸、苦參、金銀花、玄參、牛蒡子、白鮮皮、防風(fēng)、大青葉、紅花10個(gè)處方藥味，從整體上控制消銀膠囊（顆粒）的質(zhì)量及成分；本發(fā)明彌補(bǔ)了消銀膠囊/顆粒在執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)中含量測定方面的不足，以及現(xiàn)有技術(shù)中檢測方法只能反映極少藥物成分質(zhì)量情況的片面性，建立的特征圖譜測定方法是消銀膠囊/顆粒質(zhì)量控制方法的有效補(bǔ)充，能反映出所含化學(xué)成分的種類和數(shù)量，能有效表征其質(zhì)量，有利于全面控制產(chǎn)品的質(zhì)量。

29、本發(fā)明消銀膠囊/顆粒質(zhì)量檢測方法，可快速、準(zhǔn)確地鑒定不同批次、不同廠家產(chǎn)品，通過對比所得指紋圖譜中共有峰的有無，可對制劑的質(zhì)量進(jìn)行較為全面的評價(jià)，更有效的保證產(chǎn)品的質(zhì)量，具有簡單、高效、重復(fù)性及穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn)，不僅適用于消銀膠囊/顆粒的質(zhì)量控制，還可為其他中藥制劑的質(zhì)量控制提供參考和借鑒。