本發(fā)明屬于氨基酸檢測(cè)，具體涉及一種基于lc-ms/ms平臺(tái)快速檢測(cè)血漿中20種氨基酸的方法。

背景技術(shù)：

1、氨基酸,是一類(lèi)兩性有機(jī)化合物，是生物功能大分子蛋白質(zhì)的基本組成單位。根據(jù)氨基酸在體內(nèi)的合成能力，氨基酸可以分為必需氨基酸和非必需氨基酸。必需氨基酸是指人體無(wú)法自身合成，必須通過(guò)食物攝入(如，賴氨酸、色氨酸等)；而非必需氨基酸則是可以由體內(nèi)其他氨基酸或化合物合成(如，谷氨酸、丙氨酸等)。包括營(yíng)養(yǎng)不良、代謝性疾病、精神疾病和癌癥在內(nèi)的一系列疾病會(huì)影響氨基酸的代謝轉(zhuǎn)運(yùn)，導(dǎo)致人血漿中的氨基酸變化，在臨床上血漿中氨基酸譜的測(cè)定可作為代謝性疾病，精神疾病的診斷指標(biāo)。但目前，國(guó)內(nèi)外用血漿氨基酸檢測(cè)用于氨基酸代謝一場(chǎng)相關(guān)疾病的報(bào)道比較少，主要原因在于，氨基酸作為內(nèi)源性濃度極高的物質(zhì)，且在不經(jīng)過(guò)衍生化等復(fù)雜的前處理方式下，常規(guī)的檢測(cè)方法靈敏度和專(zhuān)屬性無(wú)法滿足血漿中氨基酸譜的檢測(cè)。

2、目前氨基酸檢測(cè)的常見(jiàn)方法有：紫外分光光度法、高效液相色譜法。這些方法存在前處理復(fù)雜、定性定量不夠準(zhǔn)確、成本高、分析時(shí)間長(zhǎng)、或?qū)?shí)驗(yàn)人員技術(shù)要求高等問(wèn)題。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(lc-ms/ms)越來(lái)越廣泛應(yīng)用于藥物、食品、環(huán)境、法醫(yī)、臨床等各個(gè)領(lǐng)域。lc-ms/ms具有靈敏度高，選擇性強(qiáng)，準(zhǔn)確性好等特點(diǎn)，在臨床檢測(cè)上適用范圍遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)放射性免疫檢測(cè)和化學(xué)檢測(cè)范圍，是其他方法無(wú)可比擬的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種基于lc-ms/ms技術(shù)檢測(cè)人血漿中20種氨基酸原型濃度的方法，該方法前處理簡(jiǎn)單、質(zhì)譜采集時(shí)間短、成本低廉、方便實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行大規(guī)模臨床樣本檢測(cè)。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

3、(1)樣本前處理：將樣本用生理鹽水稀釋20倍；

4、(2)將步驟(1)中得到的稀釋液體，與含有內(nèi)標(biāo)的乙腈混合，并轉(zhuǎn)移至離心管中，進(jìn)行渦旋離心處理；

5、(3)取出離心管，轉(zhuǎn)移上層離心出來(lái)的提取液至孔板中，上樣lc-ms/ms進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到血漿樣本氨基酸成分含量。

6、步驟(2)中，所述與含有內(nèi)標(biāo)的乙腈溶液的制備方法包括：先配制高濃度的氨甲環(huán)酸水溶液，然后用乙腈溶液配置成100ng/ml的內(nèi)標(biāo)溶液。

7、步驟(2)中，所述離心的轉(zhuǎn)速為10000-20000r/min，時(shí)間為5-15分鐘。

8、步驟(3)采用高效液相串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)經(jīng)過(guò)預(yù)處理的血漿樣品，利用內(nèi)標(biāo)法定量，以標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣品中各種氨基酸的濃度為橫坐標(biāo)，以各種氨基酸峰面積與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，將血漿樣品中各種氨基酸與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，計(jì)算待測(cè)血漿中20種氨基酸原型的濃度。

9、步驟(3)中，加入0.1％甲酸、5mm甲酸銨和5mm乙酸銨，將1組同分異構(gòu)體分離；所述高效液相串聯(lián)質(zhì)譜的液相色譜條件為：

10、色譜柱：agilent?advancebio?hilic-z(2.1mm×100mm,2.7μm)；

11、流速：0.25ml/min；

12、流動(dòng)相a：0.1％甲酸、5mm甲酸銨和5mm乙酸銨超純水；

13、流動(dòng)相b：0.1％甲酸、5mm甲酸銨和5mm乙酸銨的乙腈水(90：10/v：v)；

14、洗針液：甲醇：水(50：50)；

15、柱溫：35℃；自動(dòng)進(jìn)樣器溫度：4℃；

16、流動(dòng)相梯度如下表1所示：

17、表1

18、

19、優(yōu)選地，lc/ms/ms的20種氨基酸的質(zhì)譜參數(shù)如下表2所示：

20、表2

21、

22、

23、優(yōu)選地，步驟(3)中，所述校準(zhǔn)曲線的制作方法包括：樣本前處理：將樣本用生理鹽水稀釋20倍；得到的稀釋液體，與含有內(nèi)標(biāo)的乙腈混合，并轉(zhuǎn)移至離心管中，進(jìn)行渦旋離心處理；轉(zhuǎn)移上層離心出來(lái)的提取液至孔板中，上樣lc-ms/ms進(jìn)行檢測(cè)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

24、優(yōu)選地，所述校準(zhǔn)品8個(gè)水平校準(zhǔn)品，校準(zhǔn)品本底基質(zhì)為生理鹽水。

25、優(yōu)選地，校準(zhǔn)品的用量為50-200μl，含內(nèi)標(biāo)的乙腈溶液的濃度為0.1μg/ml-0.2μg/ml，添加量為250-1000μl。

26、在一些實(shí)施例中，校準(zhǔn)品的用量為50μl，內(nèi)標(biāo)的乙腈溶液的濃度為0.1mg/l，添加量為250μl。

27、優(yōu)選地，離心的轉(zhuǎn)速為10000-20000r/min，時(shí)間為5-15分鐘。

28、在一些實(shí)施例中，離心的轉(zhuǎn)速為14000r/min，時(shí)間為10分鐘。

29、優(yōu)選地，校準(zhǔn)曲線采用內(nèi)標(biāo)定量法獲得，具體包括：以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度比為x軸，以標(biāo)準(zhǔn)物與內(nèi)標(biāo)物峰面積比為y軸，建立校準(zhǔn)曲線。

30、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：(1)本發(fā)明驗(yàn)證了生理鹽水作為替代基質(zhì)的可行性，去除了氨基酸在血漿中內(nèi)源性極高而無(wú)法采用質(zhì)譜定量的問(wèn)題，相比液相等其他方法，質(zhì)譜定量的精密度，準(zhǔn)確度，靈敏度都更高。(2)樣本無(wú)需衍生化等復(fù)雜前處理方式，且方法操作簡(jiǎn)單，樣本制備時(shí)間短，方法重現(xiàn)性好。(3)本發(fā)明利用lc-ms/ms技術(shù)，建立了一種操作簡(jiǎn)便、結(jié)果穩(wěn)定可靠、快速的同時(shí)測(cè)定人血清中20種氨基酸原型濃度的方法，經(jīng)過(guò)替代基質(zhì)平行性、專(zhuān)屬性、線性、定量限、準(zhǔn)確度、儀器精密度、提取回收率、基質(zhì)效應(yīng)和穩(wěn)定性的驗(yàn)證，可用于血清種氨基酸的臨床檢測(cè)工作。

技術(shù)特征：

1.一種基于lc-ms/ms技術(shù)快速檢測(cè)血漿中20種氨基酸原型的方法，其特征在于，所述方法通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述20種氨基酸為：3-甲基組氨酸、丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、瓜氨酸、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、鳥(niǎo)氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述與含有內(nèi)標(biāo)的乙腈溶液的制備方法包括：先配制高濃度的氨甲環(huán)酸水溶液，然后用乙腈溶液配置成100ng/ml的內(nèi)標(biāo)溶液。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述離心的轉(zhuǎn)速為10000-20000r/min，時(shí)間為5-15分鐘。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，lc-ms/ms的20種氨基酸的質(zhì)譜參數(shù)如下表所示：

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，lc-ms/ms的液相色譜的條件如下，加入0.1％甲酸、5mm甲酸銨和5mm乙酸銨，將1組同分異構(gòu)體分離；其中，色譜柱：agilentadvancebio?hilic-z(2.1mm×100mm,2.7μm)；流速：0.25ml/min；流動(dòng)相a：0.1％甲酸、5mm甲酸銨和5mm乙酸銨的超純水相；流動(dòng)相b：0.1％甲酸、5mm甲酸銨和5mm乙酸銨的乙腈水90：10/v：v；流動(dòng)相梯度如下表所示：

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，所述校準(zhǔn)曲線的制作方法為：將校準(zhǔn)品稀釋20倍后加入內(nèi)標(biāo)的乙腈溶液，進(jìn)行離心，取上層提取液至96孔板中，上樣lc-ms/ms進(jìn)行檢測(cè)，得到校準(zhǔn)曲線。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開(kāi)了基于LC?MS/MS技術(shù)快速檢測(cè)血漿中20種氨基酸原型的方法。通過(guò)：(1)樣本前處理：將樣本用生理鹽水稀釋20倍；(2)將步驟A1中得到的稀釋液體，與含有內(nèi)標(biāo)的乙腈混合，并轉(zhuǎn)移至離心管中，進(jìn)行渦旋離心處理；(3)取出離心管，轉(zhuǎn)移上層離心出來(lái)的提取液至孔板中，上樣LC?MS/MS進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到血漿樣本氨基酸成分含量。本發(fā)明提供了一種檢測(cè)人血漿中氨基酸濃度的新方法，經(jīng)過(guò)替代基質(zhì)平行性、專(zhuān)屬性、線性、定量限、準(zhǔn)確度、儀器精密度、提取回收率、基質(zhì)效應(yīng)和穩(wěn)定性的驗(yàn)證，可用于血漿中20種氨基酸原型檢測(cè)，該方法前處理簡(jiǎn)單、質(zhì)譜采集時(shí)間短、成本低廉、方便實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行大規(guī)模臨床樣本檢測(cè)。

技術(shù)研發(fā)人員：余露山,林俊歡,區(qū)鳳婷,雷金秀,朱波,鄭毅
受保護(hù)的技術(shù)使用者：浙江大學(xué)金華研究院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/9