本發(fā)明屬于藥物分析檢測，關(guān)于原料藥亞硝胺類基因毒雜質(zhì)的分析，尤其涉及采用lc-msms同時(shí)檢測亞硝胺和靈敏度高的分析檢測方法，具體關(guān)于一種涉及藥品中7種亞硝胺的通用分析檢測方法。

背景技術(shù)：

1、亞硝胺雜質(zhì)的分析和控制隨著2020年ema(歐洲藥品管理局)和fda(美國食品藥品監(jiān)督管理局)亞硝胺法規(guī)的相繼出臺(tái)而日益受到重視。醫(yī)藥界對亞硝胺雜質(zhì)的認(rèn)識(shí)日益完善，評估和控制方法也變得更加科學(xué)和細(xì)致。fda指南中羅列的常見亞硝胺雜質(zhì)有7種，包括n,n-二甲基亞硝胺(ndma)、n-甲基-4-氨基丁酸亞硝胺(nmba)、n,n-二乙基亞硝胺(ndea)、n-乙基-n-異丙基亞硝胺(neipa)、n,n-二異丙基亞硝胺(ndipa)、n-甲基-n-苯基亞硝胺(nmpa)和n,n-二正丁基亞硝胺(ndba)，這些亞硝胺雜質(zhì)主要來源于工藝中的溶劑和試劑。目前，國內(nèi)外對于亞硝胺雜質(zhì)的分析尚無統(tǒng)一藥典方法。

2、美國藥典列舉了4種亞硝胺檢測方法，包括gc-msms(氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜)、hsgc-msms(高靈敏度氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜)、lc-msms(液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜)和lc-hrms(液相色譜-高分辨質(zhì)譜)。gc-msms適合檢測極性小、易揮發(fā)的亞硝胺，但對于極性大的亞硝胺如nmba無法有效檢測，且gc檢測亞硝胺容易有假陽性的情況發(fā)生。lc-hrms主要優(yōu)勢在于定性，用于定量靈敏度無法比擬三重四極桿質(zhì)譜。美國藥典的lc-msms方法，只同時(shí)檢測6種亞硝胺，且只有ndea靈敏度達(dá)到10ppb，其余亞硝胺為20ppb；關(guān)于lc-msms方法的樣品前處理，也沒有特殊方案。

3、本公司原先內(nèi)部已有部分亞硝胺雜質(zhì)分析方法，但實(shí)際應(yīng)用中樣品溶解度不夠、樣品基質(zhì)干擾目標(biāo)物檢測等。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種樣品前處理過程步驟、分析檢測操作便捷、靈敏度高且能夠滿足藥品中低含量亞硝胺分析檢測需求的檢測藥品中亞硝胺化合物的方法。

2、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的具體技術(shù)方案如下：

3、一種涉及藥品中7種亞硝胺的通用分析檢測方法，其特征在于，包括樣品前處理、液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜分析檢測(lc-msms)、定性及定量分析，具體步驟如下：

4、步驟1：有機(jī)溶劑溶解樣品，加水析出，離心取上清液，形成樣品溶液；

5、步驟2：將所述樣品溶液和對照品溶液注入液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行檢測；

6、步驟3：定性和定量分析。

7、所述7種亞硝胺為n,n-二甲基亞硝胺(ndma)，n-甲基-4-氨基丁酸亞硝胺(nmba)，n,n-二乙基亞硝胺(ndea)，n-乙基-n-異丙基亞硝胺(neipa)，n,n-二異丙基亞硝胺(ndipa)，n-甲基-n-苯基亞硝胺(nmpa)和n,n-二正丁基亞硝胺(ndba)。

8、在一些具體實(shí)施方案中，所檢測的亞硝胺可能為上述7種中的某幾種或更多種。

9、在一些具體實(shí)施方案中，所述步驟1中的有機(jī)溶劑選自甲醇、乙腈、乙醇、異丙醇、四氫呋喃(thf)、二甲基亞砜(dmso)、n,n-二甲基甲酰胺(dmf)、n,n-二甲基乙酰胺(dmac)、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮(dmi)、n-甲基-2-吡咯烷酮(nmp)中的一種或多種。

10、在一些具體實(shí)施方案中，所述步驟1的取上清液操作為靜置后取上清液或過濾后取上清液。

11、在一些具體實(shí)施方案中，所述步驟1、所述步驟2中的樣品溶液選自中控樣品、原料樣品、中間體樣品、產(chǎn)品樣品中的一種或多種。

12、在一些具體實(shí)施方案中，所述步驟2中的對照品溶液的配制方法為：合并稱量同質(zhì)量的ndma、nmba、ndea、neipa、ndipa、nmpa、ndba至容量瓶，用有機(jī)溶劑溶解并定容，混合均勻；逐步稀釋，最后加水混勻；所述步驟2還包括靈敏度溶液，所述靈敏度溶液的配制方法為：合并稱量同質(zhì)量的ndma、nmba、ndea、neipa、ndipa、nmpa、ndba至容量瓶，用有機(jī)溶劑溶解并定容，混合均勻；逐步稀釋，最后加水混勻。

13、在一些具體實(shí)施方案中，所述步驟2的色譜條件：色譜柱為agilent?zorbaxbonus-rp?150mm×4.6mm,3.5μm；柱溫40℃；進(jìn)樣器溫度5℃；流速0.7ml/min；進(jìn)樣量20μl；流動(dòng)相a為0.1％甲酸水溶液v/v；流動(dòng)相b為甲醇0～2min，90％a、10％b；2～7min，45％a、55％b；7～12min，45％a、55％b；12～13min，10％a、90％b；13～17min，10％a、90％b；17.0～17.1min，90％a、10％b；17.1～20min，90％a、10％b；所述步驟2的質(zhì)譜條件：離子源為大氣壓化學(xué)電離源apci；極性為正離子；電池加速器電壓3v；模式為多重反應(yīng)檢測mrm；氣體溫度為250℃；氣體流速6l/min；噴嘴壓力45psi；蒸發(fā)溫度350℃。

14、在一些具體實(shí)施方案中，所述步驟2中的質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置如下：

15、

16、在一些具體實(shí)施方案中，所述步驟3中的定性和定量分析的選自以下計(jì)算公式中的一種：

17、1)

18、2)

19、式中：

20、aspl：樣品溶液中目標(biāo)峰的峰面積；

21、wspl：樣品的質(zhì)量，單位為mg；

22、vspl：樣品溶液稀釋體積，單位為ml；

23、astd：對照品溶液中目標(biāo)峰的峰面積；

24、wstd：對照品溶液中各目標(biāo)雜質(zhì)的稱樣量，單位為mg；

25、vstd：對照品溶液中各目標(biāo)雜質(zhì)的稀釋體積，單位為ml。

26、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具備如下有益效果：

27、本發(fā)明的方法使得樣品基質(zhì)影響更小，通用性更強(qiáng)，本發(fā)明對fda指南中羅列的7種亞硝胺進(jìn)行通用分析方法開發(fā)，由于亞硝胺法規(guī)限度低，本發(fā)明方法通過考察多種樣品基質(zhì)，建立起合適的色譜條件，如稀釋劑、色譜柱和流動(dòng)相梯度等，讓方法真正通用。7種亞硝胺靈敏度均為10ppb水平，線性范圍100倍(10ppb-1ppm)，高中濃度加標(biāo)準(zhǔn)確度均在80％-120％，低濃度40ppb以下70％-130％，穩(wěn)定性48h以上(80％-120％)，能滿足大部分后期項(xiàng)目的檢測需求。

28、以下將結(jié)合附圖對本發(fā)明的構(gòu)思及產(chǎn)生的技術(shù)效果作進(jìn)一步說明，以充分地了解本發(fā)明的目的、特征和效果。

技術(shù)特征：

1.一種涉及藥品中7種亞硝胺的通用分析檢測方法，其特征在于，包括樣品前處理、液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜分析檢測、定性及定量分析，具體步驟如下：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟1中的有機(jī)溶劑選自甲醇、乙腈、乙醇、異丙醇、四氫呋喃、二甲基亞砜、n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮、n-甲基-2-吡咯烷酮中的一種或多種。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟1的取上清液操作為靜置后取上清液或過濾后取上清液。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟1、所述步驟2中的樣品溶液選自中控樣品、原料樣品、中間體樣品、產(chǎn)品樣品中的一種或多種。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟2中的對照品溶液的配制方法為：合并稱量同質(zhì)量的ndma、nmba、ndea、neipa、ndipa、nmpa、ndba至容量瓶，用有機(jī)溶劑溶解并定容，混合均勻；逐步稀釋，最后加水混勻；所述步驟2還包括靈敏度溶液，所述靈敏度溶液的配制方法為：合并稱量同質(zhì)量的ndma、nmba、ndea、neipa、ndipa、nmpa、ndba至容量瓶，用有機(jī)溶劑溶解并定容，混合均勻；逐步稀釋，最后加水混勻。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟2的色譜條件：色譜柱為agilentzorbax?bonus-rp?150mm×4.6mm,3.5μm；柱溫40℃；進(jìn)樣器溫度5℃；流速0.7ml/min；進(jìn)樣量20μl；流動(dòng)相a為0.1％甲酸水溶液v/v；流動(dòng)相b為甲醇0～2min，90％a、10％b；2～7min，45％a、55％b；7～12min，45％a、55％b；12～13min，10％a、90％b；13～17min，10％a、90％b；17.0～17.1min，90％a、10％b；17.1～20min，90％a、10％b；所述步驟2的質(zhì)譜條件：離子源為大氣壓化學(xué)電離源apci；極性為正離子；電池加速器電壓3v；模式為多重反應(yīng)檢測mrm；氣體溫度為250℃；氣體流速6l/min；噴嘴壓力45psi；蒸發(fā)溫度350℃。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟2中的質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置如下：

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟3中的定性和定量分析的選自以下計(jì)算公式中的一種：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種涉及藥品中7種亞硝胺的通用分析檢測方法，包括樣品前處理、液相色譜?三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜分析檢測、定性及定量分析，步驟如下：步驟1：有機(jī)溶劑溶解樣品，加水析出，離心取上清液，形成樣品溶液；步驟2：將樣品溶液和對照品溶液注入液相色譜?三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行檢測；步驟3：定性和定量分析。本發(fā)明對FDA指南中羅列的7種亞硝胺進(jìn)行通用分析方法開發(fā)，通過考察多種樣品基質(zhì)，建立起合適的色譜條件，如稀釋劑、色譜柱和流動(dòng)相梯度等，讓方法真正通用。7種亞硝胺靈敏度均為10ppb水平，線性范圍100倍(10ppb?1ppm)，高中濃度加標(biāo)準(zhǔn)確度均在80％?120％，低濃度40ppb以下70％?130％，穩(wěn)定性48h以上(80％?120％)，能滿足大部分后期項(xiàng)目的檢測需求。

技術(shù)研發(fā)人員：鄧少勝,劉佳,楊揚(yáng),蘇保寧,陳民章
受保護(hù)的技術(shù)使用者：上海合全藥物研發(fā)有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6