本發(fā)明涉及電化學(xué)免疫傳感器，具體為一種基于納米復(fù)合材料的mx1蛋白檢測(cè)超靈敏電化學(xué)免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，干擾素誘導(dǎo)的mx1蛋白是一種重要的病毒感染標(biāo)志物，它的檢測(cè)對(duì)于早期診斷病毒感染、監(jiān)測(cè)病情發(fā)展以及評(píng)估治療效果具有重要意義。特別是在兒童呼吸道疾?。ㄈ缌鞲胁《?、呼吸道合胞病毒和腺病毒感染）中，mxa蛋白檢測(cè)能夠在癥狀出現(xiàn)前提供早期感染信息，有助于及時(shí)啟動(dòng)抗病毒治療。同時(shí)，兒童呼吸道感染的病因復(fù)雜，包括病毒、細(xì)菌和其他病原體感染。mxa蛋白作為特異性病毒感染標(biāo)志物，可以幫助區(qū)分病毒性和細(xì)菌性呼吸道感染，避免不必要的抗生素濫用。通過(guò)mxa蛋白水平的檢測(cè)，可以在臨床上有效區(qū)分不同類型的感染，指導(dǎo)針對(duì)性治療，提高診斷準(zhǔn)確性?；趍xa蛋白的便攜式電化學(xué)傳感器或微流控紙基分析裝置，可以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，特別是在醫(yī)療資源有限的環(huán)境中，提供便捷的診斷工具。這種即時(shí)診斷設(shè)備能夠在短時(shí)間內(nèi)（如幾min內(nèi)）獲得檢測(cè)結(jié)果，為急性呼吸道感染患兒的診斷和治療提供及時(shí)的信息支持。

2、然而，現(xiàn)有的mx1蛋白檢測(cè)方法在靈敏度、特異性和操作簡(jiǎn)便性等方面存在以下主要問(wèn)題：(1)?現(xiàn)有的mx1蛋白檢測(cè)方法（如elisa、western?blot和qrt-pcr）在靈敏度、特異性和操作簡(jiǎn)便性方面存在明顯的局限性。elisa檢測(cè)需要復(fù)雜的樣品處理和多步驟實(shí)驗(yàn)，難以實(shí)現(xiàn)低濃度mx1蛋白的靈敏檢測(cè)；western?blot操作繁瑣且耗時(shí)，難以在臨床中快速應(yīng)用；qrt-pcr雖然可以間接檢測(cè)mx1?mrna水平，但不能反映蛋白質(zhì)的實(shí)際表達(dá)情況，且對(duì)樣本處理要求高。此外，傳統(tǒng)電化學(xué)免疫傳感器由于電極表面積小、抗體固定量不足以及非特異性吸附等問(wèn)題，在靈敏度和特異性方面也存在不足。?(2)?基于以上局限性，本發(fā)明提出一種基于納米復(fù)合材料的超靈敏電化學(xué)免疫傳感器，用于實(shí)現(xiàn)對(duì)mx1蛋白的高靈敏度、高特異性檢測(cè)。通過(guò)使用高活性表面積的硫醇化氧化石墨烯修飾電極，并結(jié)合鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)和夾層結(jié)構(gòu)的多重信號(hào)放大機(jī)制，該傳感器能夠顯著提高抗體的固定量和信號(hào)放大效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)fg/ml級(jí)別的最低檢測(cè)限。同時(shí)，優(yōu)化的電極表面修飾策略和簡(jiǎn)化的操作流程使得該傳感器在復(fù)雜生物基質(zhì)中的檢測(cè)精確度和操作簡(jiǎn)便性顯著提升，滿足病毒感染早期診斷和病情監(jiān)測(cè)的實(shí)際需求，具有良好的臨床應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，本發(fā)明的目的是提供一種基于納米復(fù)合材料的mx1蛋白檢測(cè)超靈敏電化學(xué)免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用，通過(guò)引入多種納米材料和多重信號(hào)放大機(jī)制，解決現(xiàn)有技術(shù)中靈敏度不足、操作復(fù)雜、特異性有限和信號(hào)放大效果差等問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)對(duì)mx1蛋白的超靈敏、高特異性和快速檢測(cè)，為病毒感染的早期診斷和病情監(jiān)測(cè)提供一種有效的檢測(cè)方法。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

3、一種基于納米復(fù)合材料的mx1蛋白檢測(cè)超靈敏電化學(xué)免疫傳感器的制備方法，包括以下步驟：

4、s1.玻碳電極預(yù)處理：使用0.05-0.07?μm氧化鋁漿料在拋光布上對(duì)玻碳電極表面進(jìn)行拋光，直至表面光滑且鏡面狀，然后用去離子水反復(fù)清洗電極表面，并在超聲波清洗器中依次用去離子水、無(wú)水乙醇清洗5-10min，去除表面殘留物，在氮?dú)饬飨聦㈦姌O表面吹干，得到預(yù)處理后的玻碳電極；

5、s2.硫醇化氧化石墨烯修飾：將濃度為1-3mg/ml的硫醇化氧化石墨烯分散液滴涂在清潔的預(yù)處理后的玻碳電極表面，室溫下干燥至形成均勻的硫醇化氧化石墨烯薄膜，得到硫醇化氧化石墨烯修飾電極；

6、s3.金納米粒子修飾：將0.1-1?mg/ml鏈霉親和素包被的金納米粒子溶液滴涂在硫醇化氧化石墨烯修飾電極表面，在室溫下孵育1-2h，使金納米粒子均勻分布在電極表面，用去離子水沖洗電極，除去未結(jié)合的金納米粒子，得到金納米粒子修飾電極；

7、s4.抗體固定化：將濃度為1-3μg/ml的生物素化的抗mx1單克隆抗體溶液滴涂在金納米粒子修飾電極表面，室溫孵育1-2h，用pbs緩沖液沖洗電極表面，去除未結(jié)合的抗體，得到修飾有抗體的電極；

8、s5.牛血清白蛋白封閉處理：將修飾有抗體的電極浸入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1-5%的牛血清白蛋白溶液中，室溫下孵育0.5-1h，以封閉電極表面未被抗體占據(jù)的活性位點(diǎn)，用pbs緩沖液輕柔洗滌電極表面，去除未結(jié)合的牛血清白蛋白和抗體溶液殘留物，得到基于納米復(fù)合材料的mx1蛋白檢測(cè)超靈敏電化學(xué)免疫傳感器。

9、優(yōu)選的，檢測(cè)方法所用pbs緩沖液ph均為7.4-7.8。

10、優(yōu)選的，步驟s3中，所述鏈霉親和素包被的金納米粒子的制備過(guò)程如下：

11、s301.將0.01-0.03%氯金酸溶液加熱至沸騰，加入檸檬酸鈉溶液持續(xù)攪拌和加熱10-15min后，溶液顏色變?yōu)榫萍t色后室溫冷卻，得到金納米粒子；

12、s302.離心并用去離子水洗滌金納米粒子，然后與1-3?mg/ml的聚乙二醇-巰基溶液混合，室溫?cái)嚢?.5-2h進(jìn)行表面修飾，得到聚乙二醇-巰基溶液修飾的金納米粒子；

13、s303.將1-2?mg/ml的n-乙基-n'-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和1-2?mg/ml的n-羥基琥珀酰亞胺在0.1-0.3?m的mes緩沖液中活化1-2?mg/ml的鏈霉親和素溶液，反應(yīng)0.5-1h，得到活化的鏈霉親和素；

14、s304.將活化的鏈霉親和素與聚乙二醇-巰基溶液修飾的金納米粒子混合，在室溫下攪拌1.5-2h，偶聯(lián)形成鏈霉親和素包被的金納米粒子；

15、s305.加入1-3%?bsa溶液封閉未反應(yīng)的活性位點(diǎn)，孵育0.5-1h，最后，離心去除未結(jié)合的鏈霉親和素和bsa，將鏈霉親和素包被的金納米粒子重懸于pbs緩沖液中，最終濃度為0.1-1?mg/ml，并在2-4℃條件下保存，得到鏈霉親和素包被的金納米粒子。

16、優(yōu)選的，步驟s301中，檸檬酸鈉溶液的濃度為0.01-0.03?m。

17、優(yōu)選的，步驟s302中，金納米粒子與聚乙二醇-巰基溶液的質(zhì)量比為1：1。

18、一種基于納米復(fù)合材料的mx1蛋白檢測(cè)超靈敏電化學(xué)免疫傳感器在檢測(cè)mx1蛋白中的應(yīng)用。

19、優(yōu)選的，所述應(yīng)用的方法包括以下步驟：

20、s101.mx1蛋白捕獲：將基于納米復(fù)合材料的mx1蛋白檢測(cè)超靈敏電化學(xué)免疫傳感器浸入含有待測(cè)mx1蛋白的溶液中，孵育0.5-1h，用pbs緩沖液洗滌，得到去除未結(jié)合的mx1蛋白的電極；

21、s102.夾層結(jié)構(gòu)形成：將1-3?mg/ml銀納米顆粒-抗mxa單克隆抗體b-hrp溶液滴加到去除未結(jié)合的mx1蛋白的電極表面，孵育0.5-1h，形成夾層結(jié)構(gòu)，用pbs緩沖液輕柔洗滌電極表面，去除未結(jié)合的復(fù)合物，確保信號(hào)探針與目標(biāo)蛋白形成穩(wěn)定的夾層結(jié)構(gòu)，得到形成夾層結(jié)構(gòu)的電極；

22、s103.電化學(xué)信號(hào)放大與檢測(cè)：將形成夾層結(jié)構(gòu)的電極浸入1-3mm對(duì)苯二酚和1?-3mm過(guò)氧化氫的電解質(zhì)溶液中，利用辣根過(guò)氧化物酶催化反應(yīng)生成電化學(xué)信號(hào)，使用差分脈沖伏安法測(cè)量電極的電流響應(yīng)，電流峰值與mx1蛋白的濃度成正比，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析。

23、優(yōu)選的，步驟s102中，所述銀納米顆粒-抗mxa單克隆抗體b-hrp溶液的制備步驟如下：

24、s201.將0.5?mg/ml銀納米顆粒懸浮液置于離心機(jī)中，棄去上清液，隨后用去離子水重懸顆粒，并重復(fù)離心和洗滌步驟3次，去除表面殘留的雜質(zhì)和穩(wěn)定劑，清洗后的銀納米顆粒最終重懸于0.1?m，ph?為6.0的mes緩沖液中，得到銀納米顆粒懸浮液；

25、s202.向銀納米顆粒懸浮液中加入n-乙基-n'-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和n-羥基琥珀酰亞胺，其最終濃度分別為2?mm和5?mm，混合溶液在室溫下輕柔攪拌20-30min，以活化銀納米顆粒表面的羧基官能團(tuán)，活化完成后，再次離心處理，除去未反應(yīng)的n-乙基-n'-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和n-羥基琥珀酰亞胺，并用mes緩沖液重懸銀納米顆粒，重復(fù)上述洗滌步驟2次，將最終的銀納米顆粒懸浮于mes緩沖液中備用；

26、s203.將抗mxa單克隆抗體b用mes緩沖液稀釋至1-3?mg/ml，然后將稀釋后的抗體加入到活化的銀納米顆粒懸浮液中，抗體與銀納米顆粒的質(zhì)量比為1:10，混合溶液在室溫下輕柔攪拌1-2h后離心處理，去除未結(jié)合的抗體，用pbs緩沖液重懸銀納米顆粒-抗體復(fù)合物，并重復(fù)離心和洗滌步驟3次，最終將復(fù)合物重懸于pbs緩沖液中；

27、s204.將辣根過(guò)氧化物酶用mes緩沖液稀釋至1?mg/ml，并向辣根過(guò)氧化物酶溶液中加入n-乙基-n'-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和n-羥基琥珀酰亞胺，最終濃度分別為2?mm和5?mm，室溫下輕柔攪拌20-30min，以活化辣根過(guò)氧化物酶分子上的羧基，隨后將活化的辣根過(guò)氧化物酶溶液加入到銀納米顆粒-抗體復(fù)合物懸浮液中，輕柔攪拌3-4h，確保辣根過(guò)氧化物酶與銀納米顆粒-抗體復(fù)合物上的活性位點(diǎn)發(fā)生共價(jià)偶聯(lián)反應(yīng)，偶聯(lián)反應(yīng)完成后離心處理，去除未結(jié)合的辣根過(guò)氧化物酶，用pbs緩沖液重懸銀納米顆粒-抗體-辣根過(guò)氧化物酶復(fù)合物，重復(fù)離心和洗滌步驟3次，將最終的復(fù)合物重懸于pbs緩沖液中；

28、s205.將銀納米顆粒-抗體-辣根過(guò)氧化物酶復(fù)合物懸浮液加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1-5%的牛血清白蛋白溶液中，室溫下輕柔攪拌0.5-1h，封閉處理后，再次離心處理，去除多余的牛血清白蛋白，用pbs緩沖液重懸復(fù)合物，最終將其保存于2-4℃冰箱中，避免冷凍，以防止顆粒聚集或抗體活性喪失，以上步驟完成后，再取出部分與去離子水混合即得到銀納米顆粒-抗mxa單克隆抗體b-hrp溶液。

29、優(yōu)選的，所述銀納米顆粒-抗mxa單克隆抗體b-hrp溶液的制備步驟過(guò)程中離心處理的離心機(jī)轉(zhuǎn)速均為10000-12000?rpm，時(shí)間為15-20min。

30、優(yōu)選的，步驟s204中，活化的辣根過(guò)氧化物酶溶液與銀納米顆粒-抗體復(fù)合物懸浮液的質(zhì)量比為1：10。

31、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

32、1、超高靈敏度：采用硫醇化氧化石墨烯（t-go）修飾電極，提高電極的活性表面積和電導(dǎo)率，顯著增加抗體的固定量和蛋白捕獲效率。結(jié)合鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)及夾層結(jié)構(gòu)信號(hào)探針，實(shí)現(xiàn)多重信號(hào)放大，最低檢測(cè)限可達(dá)fg/ml級(jí)別，顯著提高檢測(cè)靈敏度，能夠在病毒感染的早期階段檢測(cè)到低濃度的mx1蛋白。

33、2、高特異性：通過(guò)鏈霉親和素包被的金納米粒子和生物素化的特異性抗mx1單克隆抗體，減少非特異性吸附，保證了檢測(cè)的特異性。同時(shí)，優(yōu)化電極表面的修飾策略和保護(hù)層設(shè)計(jì)，進(jìn)一步降低背景信號(hào)干擾，提高在復(fù)雜生物基質(zhì)中的檢測(cè)準(zhǔn)確性。

34、3、方法簡(jiǎn)便、快速檢測(cè)：檢測(cè)方法相對(duì)簡(jiǎn)單，通過(guò)一次性修飾電極即可完成整個(gè)檢測(cè)流程，省去傳統(tǒng)方法中繁瑣的樣品處理步驟和復(fù)雜實(shí)驗(yàn)設(shè)備的需求。檢測(cè)時(shí)間大大縮短，適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)和即時(shí)診斷。

35、4、多重信號(hào)放大機(jī)制：采用夾層結(jié)構(gòu)的多重信號(hào)放大機(jī)制，通過(guò)銀納米粒子與hrp復(fù)合物的協(xié)同作用，顯著放大電化學(xué)信號(hào)，提升檢測(cè)靈敏度和精度。該方法有效克服了傳統(tǒng)電化學(xué)傳感器單一信號(hào)放大機(jī)制的局限性。

36、5、廣泛的臨床應(yīng)用前景：本發(fā)明可用于早期病毒感染的快速篩查、病情監(jiān)測(cè)及治療效果評(píng)估，特別是在公共衛(wèi)生和臨床診斷領(lǐng)域，具有廣泛的應(yīng)用前景。同時(shí)，該技術(shù)平臺(tái)可拓展用于其他蛋白質(zhì)或生物標(biāo)志物的檢測(cè)，具備良好的通用性和可擴(kuò)展性。綜上所述，本發(fā)明在靈敏度、特異性、操作簡(jiǎn)便性及信號(hào)放大機(jī)制方面均優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)，為mx1蛋白的快速、超靈敏檢測(cè)提供了創(chuàng)新性解決方案，有助于病毒感染的早期診斷和臨床監(jiān)測(cè)。