本發(fā)明屬于熒光染色，具體涉及一種實(shí)時(shí)示蹤胞內(nèi)微孢子蟲增殖發(fā)育的熒光標(biāo)記方法。

背景技術(shù)：

1、微孢子蟲是一類專性細(xì)胞內(nèi)的寄生蟲，全球已報(bào)道約220個(gè)屬，1700余種，且每年都有新的物種被報(bào)道。微孢子蟲的宿主范圍和分布極為廣泛，能感染幾乎所有的無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物，如人，兔，家蠶，蜜蜂和蟹。部分微孢子蟲是人類、畜牧、水產(chǎn)與家蠶、蜜蜂的經(jīng)濟(jì)昆蟲的重要病原生物，給人類健康與經(jīng)濟(jì)發(fā)展造成了嚴(yán)重?fù)p失，但迄今缺乏有效防控微孢子蟲病的手段。作為胞內(nèi)病原，對(duì)微孢子蟲成熟孢子侵染宿主細(xì)胞及其后在胞內(nèi)增殖發(fā)育過程與適應(yīng)胞內(nèi)生存的機(jī)制了解的缺乏是阻礙發(fā)展微孢子蟲病防控措施的重要瓶頸。而在微孢子蟲細(xì)胞生物學(xué)及其與宿主相互作用的研究中，標(biāo)記微孢子蟲的入胞與胞內(nèi)增殖發(fā)育過程對(duì)揭示微孢子蟲的胞內(nèi)適應(yīng)性生存機(jī)制有重要意義。當(dāng)前，受限于微孢子蟲遺傳操作技術(shù)的缺乏，基于轉(zhuǎn)基因技術(shù)利用特異性強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)gfp等熒光標(biāo)記基因表達(dá)，以獲得穩(wěn)定熒光示蹤的微孢子蟲株，仍然是一個(gè)尚未涉足的領(lǐng)域。

2、目前，常用的細(xì)胞內(nèi)微孢子蟲的標(biāo)記方法包括免疫學(xué)方法和熒光染色方法。免疫學(xué)方法?；诳乖涂贵w的特異性結(jié)合。免疫學(xué)方法首先需要對(duì)已知的微孢子蟲裂殖體或成熟孢子的特異性蛋白進(jìn)行體外表達(dá)和純化，隨后制備多克隆抗體，并與熒光二抗聯(lián)用以實(shí)現(xiàn)微孢子蟲裂殖體或成熟孢子的定位。熒光染色方法則主要針對(duì)微孢子蟲孢壁的幾丁質(zhì)進(jìn)行染色，因此，熒光染色方法也僅限于標(biāo)記孢子體和成熟孢子。此外，無(wú)論是免疫學(xué)方法還是熒光染色方法，都必須首先固定和透化細(xì)胞，才能使抗體或染料進(jìn)入細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記。因此，這兩種方法均無(wú)法同時(shí)標(biāo)記微孢子蟲的各個(gè)發(fā)育階段，也無(wú)法標(biāo)記微孢子蟲活細(xì)胞，進(jìn)而無(wú)法實(shí)時(shí)示蹤微孢子蟲的增殖發(fā)育。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決現(xiàn)有技術(shù)中細(xì)胞內(nèi)微孢子蟲標(biāo)記方法不能對(duì)微孢子蟲的增殖發(fā)育進(jìn)行實(shí)時(shí)示蹤的問題，本發(fā)明提供了一種實(shí)時(shí)示蹤胞內(nèi)微孢子蟲增殖發(fā)育的熒光標(biāo)記方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案。

2、本發(fā)明提供了一種實(shí)時(shí)示蹤胞內(nèi)微孢子蟲增殖發(fā)育的熒光標(biāo)記方法，包括如下步驟：

3、收集微孢子蟲的成熟孢子。

4、使用親脂性碳菁類染料配制的染色液對(duì)所述微孢子蟲的成熟孢子進(jìn)行染色，獲得染色后的微孢子蟲的成熟孢子。

5、將染色后的微孢子蟲的成熟孢子接種至正在培養(yǎng)的宿主細(xì)胞中進(jìn)行感染，獲得活細(xì)胞樣品。

6、在感染后的5小時(shí)~120小時(shí)，使用激光共聚焦顯微鏡對(duì)所述活細(xì)胞樣品進(jìn)行觀察。

7、所述親脂性碳菁類染料包括dii和did中的任意一種。

8、現(xiàn)有技術(shù)中，細(xì)胞內(nèi)微孢子蟲的標(biāo)記方法主要包括免疫學(xué)方法和熒光染色方法。其中，免疫學(xué)方法通常為通過體外表達(dá)微孢子蟲的管家基因或孢壁蛋白，然后免疫動(dòng)物獲得相應(yīng)抗體，并與熒光標(biāo)記的二抗聯(lián)用，最終實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)微孢子蟲裂殖體或成熟孢子的標(biāo)記。熒光染色方法主要針對(duì)微孢子蟲的幾丁質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。因此，熒光染色方法僅能標(biāo)記孢子體和成熟孢子。此外，無(wú)論是免疫學(xué)方法還是熒光染色方法，都必須首先固定和透化細(xì)胞，才能使抗體或染料進(jìn)入細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記。因此，現(xiàn)有的免疫學(xué)方法和熒光染色法均存在無(wú)法同步標(biāo)記或?qū)崟r(shí)示蹤微孢子蟲的各個(gè)發(fā)育階段，也無(wú)法標(biāo)記微孢子蟲活細(xì)胞的技術(shù)缺陷。

9、基于解決上述技術(shù)缺陷，本發(fā)明提供了一種基于活細(xì)胞的，能同時(shí)標(biāo)記微孢子蟲各個(gè)增殖階段的，并且能實(shí)時(shí)示蹤胞內(nèi)微孢子蟲增殖發(fā)育的熒光標(biāo)記方法。本發(fā)明使用的dii或did是親脂性碳菁類熒光染料，能夠與細(xì)胞膜中的脂質(zhì)分子結(jié)合并嵌入活細(xì)胞的細(xì)胞膜中，且能長(zhǎng)時(shí)間保留在細(xì)胞膜上并隨細(xì)胞分裂傳遞給子細(xì)胞。因此，本發(fā)明能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)微孢子蟲及其各個(gè)發(fā)育階段的活細(xì)胞標(biāo)記和實(shí)時(shí)示蹤。該方法有效解決了現(xiàn)有技術(shù)中不能對(duì)微孢子蟲的增殖發(fā)育進(jìn)行實(shí)時(shí)示蹤的問題，填補(bǔ)了基于活細(xì)胞的連續(xù)示蹤微孢子蟲胞內(nèi)增殖發(fā)育方法的空缺。

10、優(yōu)選地，所述染色后的微孢子蟲的成熟孢子的獲得方法，包括如下步驟：

11、所述微孢子蟲的成熟孢子離心后，收集孢子沉淀，加入所述親脂性碳菁類染料配制的染色液重懸后，于室溫保持10min；再次離心，收集孢子沉淀并用pbs溶液重懸洗滌，即得所述染色后的微孢子蟲的成熟孢子。此時(shí)微孢子蟲的成熟孢子的膜結(jié)構(gòu)已被親脂性碳菁類染料標(biāo)記，以動(dòng)態(tài)示蹤后續(xù)微孢子蟲感染宿主細(xì)胞和在宿主細(xì)胞中的增殖發(fā)育過程。

12、優(yōu)選地，離心的條件為8000g離心5min。使用8000g離心5min能較好地收集孢子沉淀。

13、dii和did是親脂性的熒光染料，可用來(lái)染細(xì)胞膜和其它脂溶性生物結(jié)構(gòu)，用于活細(xì)胞或組織的長(zhǎng)期示蹤劑。兩種染料具有不同的激發(fā)波長(zhǎng)，分別呈現(xiàn)橙色和紅色的熒光顏色，在與其他染料聯(lián)用時(shí)可被靈活選擇。

14、優(yōu)選地，所述染色的時(shí)間為10min。所述親脂性碳菁類染料在染色10min對(duì)微孢子蟲的增殖發(fā)育有較好的示蹤效果。

15、優(yōu)選地，所述親脂性碳菁類染料配制的染色液的終濃度為5μm。所述親脂性碳菁類染料在終濃度為5μm時(shí)對(duì)微孢子蟲的增殖發(fā)育有較好的示蹤效果。

16、優(yōu)選地，pbs溶液的濃度為0.01m，ph為7.3。

17、優(yōu)選地，染色后的微孢子蟲的成熟孢子接種至正在培養(yǎng)的宿主細(xì)胞中的方法包括如下步驟：

18、待正在培養(yǎng)的宿主細(xì)胞培養(yǎng)至匯合度達(dá)到80%時(shí)，將所述染色后的微孢子蟲的成熟孢子接種至正在培養(yǎng)的宿主細(xì)胞中共同培養(yǎng)。

19、共同培養(yǎng)的條件為37℃、5%?co2、95%濕度。該培養(yǎng)條件為兔腎細(xì)胞的最適生長(zhǎng)條件。

20、優(yōu)選地，在感染后5小時(shí)~120小時(shí)內(nèi)，所述親脂性碳菁類染料對(duì)微孢子蟲的增殖發(fā)育有很好的示蹤效果。

21、優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞為兔腎細(xì)胞。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中以梭子蟹肌孢蟲的宿主細(xì)胞兔腎細(xì)胞為研究對(duì)象，同樣也適用于其他微孢子蟲的宿主細(xì)胞。

22、優(yōu)選地，所述微孢子蟲為梭子蟹肌孢蟲。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中以梭子蟹肌孢蟲為研究對(duì)象，同樣也適用于其他種屬微孢子蟲。

23、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

24、1、本發(fā)明提供的一種實(shí)時(shí)示蹤胞內(nèi)微孢子蟲增殖發(fā)育的熒光標(biāo)記方法解決了基于轉(zhuǎn)基因技術(shù)示蹤微孢子蟲的難題，填補(bǔ)了實(shí)時(shí)示蹤胞內(nèi)處于不同發(fā)育階段的微孢子蟲的空缺，大大降低科研成本和技術(shù)要求；替代了基于細(xì)胞固定和通透的雙色或多色熒光染色步驟來(lái)標(biāo)記不同增殖時(shí)期微孢子蟲的復(fù)雜方法，操作方便，步驟簡(jiǎn)單，不需要專業(yè)技術(shù)人員，大大縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間。本發(fā)明提供的該實(shí)時(shí)示蹤胞內(nèi)微孢子蟲增殖發(fā)育的熒光標(biāo)記方法不需在細(xì)胞固定和通透的基礎(chǔ)上進(jìn)行，不會(huì)破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和抗原表位，能夠準(zhǔn)確反映活細(xì)胞中的真實(shí)狀況，有效解決了現(xiàn)有技術(shù)中不能對(duì)微孢子蟲的增殖發(fā)育進(jìn)行實(shí)時(shí)示蹤的問題，填補(bǔ)了基于活細(xì)胞的連續(xù)示蹤微孢子蟲胞內(nèi)增殖發(fā)育方法的空缺。

25、2、目前缺乏同時(shí)標(biāo)記微孢子蟲各個(gè)發(fā)育階段的方法和基于活細(xì)胞的連續(xù)示蹤其胞內(nèi)增殖發(fā)育的方法；現(xiàn)有的胞內(nèi)微孢子蟲增殖發(fā)育的熒光標(biāo)記方法均需一種以上的方法或染料，對(duì)研究造成不便，且均需在細(xì)胞固定和通透的基礎(chǔ)上進(jìn)行，可能難以準(zhǔn)確反映活細(xì)胞中的真實(shí)狀況。本發(fā)明提供的該實(shí)時(shí)示蹤胞內(nèi)微孢子蟲增殖發(fā)育的熒光標(biāo)記方法能夠有效解決上述問題。

26、3、本發(fā)明提供的該實(shí)時(shí)示蹤胞內(nèi)微孢子蟲增殖發(fā)育的熒光標(biāo)記方法易于結(jié)合多色熒光標(biāo)記進(jìn)行微孢子蟲胞內(nèi)實(shí)時(shí)“生態(tài)位”和與宿主細(xì)胞器實(shí)時(shí)互作的研究；本發(fā)明的該實(shí)時(shí)示蹤胞內(nèi)微孢子蟲增殖發(fā)育的熒光標(biāo)記方法中碳菁類染料家族包含不同光譜的兩種：dii和did，最大激發(fā)波長(zhǎng)分別為549nm和644nm，且色譜范圍窄，在與其他染料聯(lián)用時(shí)可被靈活選擇，具有巨大的應(yīng)用潛力。

27、4、本發(fā)明提供的該實(shí)時(shí)示蹤胞內(nèi)微孢子蟲增殖發(fā)育的熒光標(biāo)記方法還具有如下優(yōu)點(diǎn)：

28、（1）親脂性碳菁類染料配制的染色液可對(duì)微孢子蟲的成熟孢子進(jìn)行染色，而不影響其侵染活性。

29、（2）親脂性碳菁類染料配制的染色液可標(biāo)記微孢子蟲胞內(nèi)發(fā)育的裂殖生殖和孢子生殖各發(fā)育階段。

30、（3）使用激光共聚焦顯微鏡可實(shí)時(shí)觀察感染后不同時(shí)間點(diǎn)微孢子蟲的胞內(nèi)發(fā)育階段。