本發(fā)明屬于血漿中藥物檢測，尤其是涉及一種快速檢測人血漿中鎮(zhèn)靜催眠藥的方法。

背景技術(shù)：

1、鎮(zhèn)靜催眠類藥物的種類繁多，除經(jīng)典的苯二氮?類藥物（地西泮、阿普唑侖、勞拉西泮、三唑侖、咪達唑侖、硝西泮、氯硝西泮、氟硝西泮、奧沙西泮和艾司唑侖）外，新型鎮(zhèn)靜催眠類藥物扎來普隆、佐匹克隆及唑吡坦亦被廣泛應(yīng)用。臨床上，過量服用鎮(zhèn)靜催眠類藥物導(dǎo)致的中毒病例十分常見，該類中毒患者可由輕度的鎮(zhèn)靜催眠發(fā)展至昏迷甚至死亡。

2、鎮(zhèn)靜催眠類藥物中毒患者入院后，通常意識不清或昏迷，臨床醫(yī)生難以判斷中毒類型，因此，需采用快速、準(zhǔn)確的定性檢測方法，對該類患者進行確診，進而開展對癥治療。該類中毒患者的后期血液凈化治療過程中，需定量檢測人血漿中該類藥物的濃度，通過對比血液凈化前后的藥物濃度，來評估治療效果。

3、已有報道的鎮(zhèn)靜催眠類藥物檢測方法，因具有多種劣勢，致其無法在臨床使用：

4、（1）可檢測的藥物種類不全，缺乏扎來普隆、佐匹克隆及唑吡坦這些新型催眠類藥物。

5、（2）檢測方法不適宜，苯二氮?類藥物中不同藥物的極性相差很小，液相色譜-紫外法無法將該類藥物從色譜上基線分離，而不同藥物的結(jié)構(gòu)相似性使其在紫外光譜上也難以區(qū)分；此外，紫外檢測器靈敏度不足，無法檢測濃度在1μg/ml以下的低濃度樣本。盡管氣相色譜-質(zhì)譜法可有效改善分離度差的問題，但其檢測限集中在0.1-10μg/ml，仍無法解決靈敏度問題。

6、（3）已有報道的樣本處理方法多采用有機溶劑液液萃取后吹干復(fù)溶，不僅樣本需求量大，而且前處理復(fù)雜，報告時限在3小時以上，無法滿足臨床中毒檢測的迫切需求。

7、（4）不同種鎮(zhèn)靜催眠類藥物的治療濃度范圍、中毒預(yù)警濃度不同，已有報道的檢測線性范圍未完全覆蓋，導(dǎo)致應(yīng)用時無法準(zhǔn)確檢測。

8、（5）鎮(zhèn)靜催眠類藥物檢測如用于中毒患者，首先需要定性鑒別藥物種類，然后進行定量檢測，目前臨床上并無可靠的定性判定方法。

9、因此，急需一種前處理方法簡單、線性范圍和靈敏度適宜、成本低廉、可快速精準(zhǔn)定性定量檢測人血漿樣本中13種鎮(zhèn)靜催眠藥的方法。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供一種快速檢測人血漿中鎮(zhèn)靜催眠藥的方法，以解決背景技術(shù)中的問題。

2、本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種快速檢測人血漿中鎮(zhèn)靜催眠藥的方法，其包括步驟：將供試樣本與內(nèi)標(biāo)沉淀劑混勻，震蕩渦旋得供試樣本上清液，利用超高效液相色譜聯(lián)用質(zhì)譜技術(shù)對供試樣本上清液中的鎮(zhèn)靜催眠藥進行定性和定量檢測；

3、超高效液相色譜的條件包括：梯度洗脫；流動相a為甲酸的乙腈溶液，甲酸的體積分?jǐn)?shù)為0.01%~1%；流動相b為含甲酸和甲酸銨的水溶液，甲酸的體積分?jǐn)?shù)為0.01%~1%，甲酸銨的濃度為5~20mm；

4、梯度洗脫時：初始時流動相b的占比≥90%，4min時流動相b的占比降至5%~10%，其中，流動相b占比的降速先慢后快。

5、進一步的，超高效液相色譜的條件包括：色譜柱填料為十八烷基硅烷鍵合硅膠；流速為0.3~0.5ml/min，柱溫為35~40℃，進樣量為2~10μl。

6、進一步的，梯度洗脫的條件為：

7、0.0min，流動相a，10%；流動相b，90%；

8、3.0min：流動相a，40%；流動相b，60%；

9、4.0min：流動相a，90%；流動相b，10%；

10、5.0min：流動相a，10%；流動相b，90%；

11、或者，

12、0.0min，流動相a，10%；流動相b，90%；

13、2.5min：流動相a，35%；流動相b，65%；

14、4.0min：流動相a，95%；流動相b，5%；

15、5.0min：流動相a，10%；流動相b，90%。

16、進一步的，色譜柱填料的顆粒粒徑為1.7μm。

17、進一步的，超高效液相色譜中色譜柱的型號為waters?acquity?beh?c18，色譜柱柱長為50mm，內(nèi)徑為2.1mm。

18、進一步的，質(zhì)譜條件為：

19、正離子電噴霧離子源，多反應(yīng)監(jiān)測mrm，毛細(xì)管電壓為0.5~1.0kv，脫溶劑氣溫度400~500℃，脫溶劑氣流量為600~800l/hr，錐孔氣流速為40~60l/hr。

20、進一步的，所述方法可檢測的13種鎮(zhèn)靜催眠藥包括：地西泮、阿普唑侖、勞拉西泮、三唑侖、咪達唑侖、硝西泮、氯硝西泮、氟硝西泮、奧沙西泮、艾司唑侖、佐匹克隆、唑吡坦、扎來普??；利用所述方法檢測所述13種鎮(zhèn)靜催眠藥時，利用所述方法檢測所述13種鎮(zhèn)靜催眠藥時，內(nèi)標(biāo)沉淀劑中含有內(nèi)標(biāo)物和第二溶劑，內(nèi)標(biāo)物包括地西泮-d5和/或佐匹克隆-d4，第二溶劑中含有乙腈和甲酸，甲酸的體積分?jǐn)?shù)為0.01%~1%。

21、進一步的，對供試樣本上清液進行定性檢測的步驟包括：

22、配制質(zhì)控樣本，質(zhì)控樣本中含有鎮(zhèn)靜催眠藥標(biāo)準(zhǔn)品和空白血漿；

23、將質(zhì)控樣本和內(nèi)標(biāo)沉淀劑混勻，震蕩渦旋得質(zhì)控樣本上清液，利用超高效液相色譜聯(lián)用質(zhì)譜技術(shù)對質(zhì)控樣本上清液中的13種鎮(zhèn)靜催眠藥進行分離和定性檢測，質(zhì)控樣本上清液和供試樣本上清液的檢測條件相同；

24、對比質(zhì)控樣本上清液和供試樣本上清液的檢測結(jié)果，依據(jù)保留時間、雙通道m(xù)rm色譜圖、子離子豐度比逐步判定供試樣本上清液中所含鎮(zhèn)靜催眠藥的種類。

25、進一步的，對供試樣本上清液進行定量檢測的步驟包括標(biāo)定標(biāo)準(zhǔn)樣本，其操作為：

26、配制標(biāo)準(zhǔn)樣本，標(biāo)準(zhǔn)樣本中含有鎮(zhèn)靜催眠藥標(biāo)準(zhǔn)品和空白血漿；將標(biāo)準(zhǔn)樣本與內(nèi)標(biāo)沉淀劑混勻，震蕩渦旋得標(biāo)準(zhǔn)樣本上清液，利用超高效液相色譜聯(lián)用質(zhì)譜技術(shù)對標(biāo)準(zhǔn)樣本上清液中的13種鎮(zhèn)靜催眠藥進行分離和定量檢測，標(biāo)準(zhǔn)樣本上清液和供試樣本上清液的檢測條件相同；

27、以各鎮(zhèn)靜催眠藥的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)- x、各鎮(zhèn)靜催眠藥與內(nèi)標(biāo)物的色譜峰面積比為縱坐標(biāo)- y，采用加權(quán)最小二乘法進行線性回歸，加權(quán)因子為1/ x2，分別得到13種鎮(zhèn)靜催眠藥的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

28、進一步的，所述方法對13種鎮(zhèn)靜催眠藥進行檢測的定量下限分別為：

29、地西泮：62.5ng/ml；

30、阿普唑侖：3.125ng/ml；

31、艾司唑侖：31.25ng/ml；

32、勞拉西泮：12.5ng/ml；

33、三唑侖：3.125ng/ml；

34、咪達唑侖：62.5ng/ml；

35、硝西泮：6.25ng/ml；

36、氟硝西泮：6.25ng/ml；

37、氯硝西泮：3.125ng/ml；

38、奧沙西泮：31.25ng/ml；

39、唑吡坦：12.5ng/ml；

40、佐匹克?。?2.5ng/ml；

41、扎拉普隆：3.125ng/ml。

42、本發(fā)明具有的優(yōu)點和積極效果至少包括：

43、（1）提供了既能夠穩(wěn)定、充分溶解鎮(zhèn)靜催眠藥標(biāo)準(zhǔn)品和同位素內(nèi)標(biāo)，又能將血漿中的蛋白沉淀的第二溶劑，利用第二溶劑可以一次性完成內(nèi)標(biāo)物的添加和蛋白沉淀兩個工序，大大降低了樣本的前處理時間，有助于臨床上對鎮(zhèn)靜催眠藥中毒患者快速診斷的實施。

44、（2）提供了利用超高效液相色譜聯(lián)用質(zhì)譜技術(shù)快速檢測人血漿中鎮(zhèn)靜催眠藥的方法，開發(fā)了人血漿中10種苯二氮?類藥物（地西泮、阿普唑侖、勞拉西泮、三唑侖、咪達唑侖、硝西泮、氯硝西泮、氟硝西泮、奧沙西泮和艾司唑侖）和3種新型鎮(zhèn)靜催眠類藥物（佐匹克隆、唑吡坦和扎來普隆）的定性定量方法，針對不同種鎮(zhèn)靜催眠藥的治療濃度范圍、中毒預(yù)警濃度，分別設(shè)置了不同的檢測濃度線性范圍，并進行了方法學(xué)驗證，分析精準(zhǔn)、定量下限低、樣本需求量少（僅需200μl）、樣品前處理簡單且耗時短、檢測時長短（上樣分析時間僅為5min，1小時內(nèi)即可出具檢測報告），為鎮(zhèn)靜催眠類藥物中毒患者的快速、準(zhǔn)確診斷和治療提供了方法支持。